轉(zhuǎn)移抑制基因mtss1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的研究

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1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)移抑制基因MTSS1在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的研究姓名：柳珂申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：王杰軍201206轉(zhuǎn)移抑制候選基因MTSSl在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的研究摘要胃癌所具有的高轉(zhuǎn)移特性是該類型腫瘤預(yù)后較羞的主要原因，深入探索其相關(guān)機制對提高患者生存率意義重大。候選基因MTSSl作為一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前研究認(rèn)為其通過影響細(xì)胞骨架的改變遷移等而與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。該基因在腫瘤中的研究目前尚是新的領(lǐng)域，迄今為止國內(nèi)外尚無有關(guān)于胃癌中的實驗研究報道。本實驗擬研究MTSSl在胃癌組織中多水平的表達(dá)情況及其與患者臨床病理的相

2、關(guān)性，同時檢測MTSSl雜合性缺失的情況，以明確在腫瘤進(jìn)程中該基因失活可能的機制。并在此基礎(chǔ)上深入研究MTSSl在體內(nèi)外對胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的影響及其可能的機制。通過本課題的研究，可將MTSSl挖掘成為一種對于腫瘤的預(yù)后與轉(zhuǎn)移具有指示作用的新興標(biāo)志物以及阻斷胃癌轉(zhuǎn)移的可能靶點。第一部分MTSSl在人胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系目的：研究MTSSl在人類胃癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理的相關(guān)性，以初步探討MTSSl在人類胃癌中表達(dá)的生物學(xué)意義。方法：在包含胃癌癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結(jié)或其他轉(zhuǎn)移灶的胃癌組織樣本1072例的組織芯片中，利用

3、免疫組化、RT．PCR等實驗技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平檢測MTSSl的表達(dá)。并結(jié)合臨床病理資料對實驗結(jié)果統(tǒng)計分析，探尋MTSSl在人胃癌中表達(dá)的臨床意義。結(jié)果i(1)胃癌組織及胃癌淋巴結(jié)或其他轉(zhuǎn)移組織中MTSSl蛋白表達(dá)強度和表達(dá)率較癌旁正常粘膜組織中明顯下降。MTSSl在胃癌原發(fā)灶組織中表達(dá)缺失率為70．1％(751／1072)，在胃癌淋巴結(jié)及其他轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)缺失率達(dá)88％(103／1171。RT．PCR、Westernblot中結(jié)果趨勢也同上較一致。(2)MTSSl在胃癌中的表達(dá)與較多因素相關(guān)：隨著腫瘤分化程度向低或未分化進(jìn)展，MTSSl=的表達(dá)逐

4、漸減少，故與腫瘤分化程度相關(guān)(P<0．001)。另其與腫瘤大小(P=0．005)，腫瘤浸潤深度，組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均相關(guān)(P

5、在的判斷預(yù)后有效指標(biāo)。第二部分MTSSl在胃癌組織中表達(dá)缺失的相關(guān)機制研究目的：探討腫瘤轉(zhuǎn)移抑制候選基因(Metastasissuppressor1,MTSSl)在胃癌發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中的可能的分子機制。方法：運用PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳．銀染法對含癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移灶的胃癌組織樣本各13例MTSSl基因位點上4個微衛(wèi)星位點(D8S1832、D8S2132、D8S1179、D8S1461)進(jìn)行雜合性缺失(10ssofheterozygosity,LOH)檢測。結(jié)果：在MTSSl表達(dá)陰性的胃癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移組織中LOH發(fā)生率較高，總LOH

6、率分別為46．15％和69．23％。結(jié)論：MTSSl基因位點頻繁的雜合性缺失可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中起到了一定的作用。第三部分轉(zhuǎn)移抑制基因MTSSl在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞學(xué)功能研究目的：應(yīng)用定向基因克隆技術(shù)，構(gòu)建MTSSl基因真核表達(dá)載體pEGFP．N1．MTSSl，建立并鑒定能穩(wěn)定表達(dá)外源MTSSl基因的胃癌細(xì)胞系。通過基因雙向表達(dá)調(diào)控以研究MTSSl基因?qū)GS和MGc80．3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的機理。方法：1、通過基因克隆技術(shù)獲得人MTSSl基因cDNA序列，將其克隆至T載體，測序正確后，經(jīng)酶切、回收并連接到真核細(xì)胞表達(dá)載體pEG

7、FP．N1，構(gòu)建pEGFP．N1．MTSSl表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定、測序正確后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP．N1．MTSSl表達(dá)載體和設(shè)計合成的干擾序列ShRNA431分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株AGS和MGcS0．3細(xì)胞，根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)率確定轉(zhuǎn)染效率，利用Realtime．PCR、免疫印跡法鑒定表達(dá)產(chǎn)物，紫外．可見分光光度法測定MTSSl活性的改變。2、以成功構(gòu)建的分別能穩(wěn)定表達(dá)外源pEGFP．N1．MTSSl，瞬轉(zhuǎn)ShRNA431，空載體pEGFP．N1／對照NC的胃癌細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)染的AGS／MGc80．3細(xì)胞為研究對象，通過MTTlY,色、平板克隆集落

8、形成、transwelld,室侵襲遷移實驗以及裸鼠體