轉移抑制基因mtss1在胃癌侵襲轉移中的研究

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1、第二軍醫(yī)大學博士學位論文轉移抑制基因MTSS1在胃癌侵襲轉移中的研究姓名：柳珂申請學位級別：博士專業(yè)：腫瘤學指導教師：王杰軍201206轉移抑制候選基因MTSSl在胃癌侵襲轉移中的研究摘要胃癌所具有的高轉移特性是該類型腫瘤預后較羞的主要原因，深入探索其相關機制對提高患者生存率意義重大。候選基因MTSSl作為一種新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉移抑制基因，目前研究認為其通過影響細胞骨架的改變遷移等而與腫瘤的侵襲轉移相關聯(lián)。該基因在腫瘤中的研究目前尚是新的領域，迄今為止國內外尚無有關于胃癌中的實驗研究報道。本實驗擬研究MTSSl在胃癌組織中多水平的表達情況及其與患者臨床病理的相

2、關性，同時檢測MTSSl雜合性缺失的情況，以明確在腫瘤進程中該基因失活可能的機制。并在此基礎上深入研究MTSSl在體內外對胃癌細胞侵襲轉移生物學行為的影響及其可能的機制。通過本課題的研究，可將MTSSl挖掘成為一種對于腫瘤的預后與轉移具有指示作用的新興標志物以及阻斷胃癌轉移的可能靶點。第一部分MTSSl在人胃癌組織中的表達與臨床病理特征及預后的關系目的：研究MTSSl在人類胃癌中的表達情況及其與臨床病理的相關性，以初步探討MTSSl在人類胃癌中表達的生物學意義。方法：在包含胃癌癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結或其他轉移灶的胃癌組織樣本1072例的組織芯片中，利用

3、免疫組化、RT．PCR等實驗技術分別從mRNA水平和蛋白水平檢測MTSSl的表達。并結合臨床病理資料對實驗結果統(tǒng)計分析，探尋MTSSl在人胃癌中表達的臨床意義。結果i(1)胃癌組織及胃癌淋巴結或其他轉移組織中MTSSl蛋白表達強度和表達率較癌旁正常粘膜組織中明顯下降。MTSSl在胃癌原發(fā)灶組織中表達缺失率為70．1％(751／1072)，在胃癌淋巴結及其他轉移灶中表達缺失率達88％(103／1171。RT．PCR、Westernblot中結果趨勢也同上較一致。(2)MTSSl在胃癌中的表達與較多因素相關：隨著腫瘤分化程度向低或未分化進展，MTSSl=的表達逐

4、漸減少，故與腫瘤分化程度相關(P<0．001)。另其與腫瘤大小(P=0．005)，腫瘤浸潤深度，組織類型、淋巴結轉移以及TNM分期均相關(P

5、在的判斷預后有效指標。第二部分MTSSl在胃癌組織中表達缺失的相關機制研究目的：探討腫瘤轉移抑制候選基因(Metastasissuppressor1,MTSSl)在胃癌發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉移中的可能的分子機制。方法：運用PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳．銀染法對含癌旁正常粘膜、原發(fā)灶、淋巴結轉移或轉移灶的胃癌組織樣本各13例MTSSl基因位點上4個微衛(wèi)星位點(D8S1832、D8S2132、D8S1179、D8S1461)進行雜合性缺失(10ssofheterozygosity,LOH)檢測。結果：在MTSSl表達陰性的胃癌原發(fā)及轉移組織中LOH發(fā)生率較高，總LOH

6、率分別為46．15％和69．23％。結論：MTSSl基因位點頻繁的雜合性缺失可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉移中起到了一定的作用。第三部分轉移抑制基因MTSSl在胃癌侵襲轉移中的細胞學功能研究目的：應用定向基因克隆技術，構建MTSSl基因真核表達載體pEGFP．N1．MTSSl，建立并鑒定能穩(wěn)定表達外源MTSSl基因的胃癌細胞系。通過基因雙向表達調控以研究MTSSl基因對AGS和MGc80．3細胞生物學行為的影響及其可能的機理。方法：1、通過基因克隆技術獲得人MTSSl基因cDNA序列，將其克隆至T載體，測序正確后，經酶切、回收并連接到真核細胞表達載體pEG

7、FP．N1，構建pEGFP．N1．MTSSl表達載體，經酶切鑒定、測序正確后，用脂質體轉染技術將pEGFP．N1．MTSSl表達載體和設計合成的干擾序列ShRNA431分別轉染人胃癌細胞株AGS和MGcS0．3細胞，根據綠色熒光蛋白的表達率確定轉染效率，利用Realtime．PCR、免疫印跡法鑒定表達產物，紫外．可見分光光度法測定MTSSl活性的改變。2、以成功構建的分別能穩(wěn)定表達外源pEGFP．N1．MTSSl，瞬轉ShRNA431，空載體pEGFP．N1／對照NC的胃癌細胞系和未轉染的AGS／MGc80．3細胞為研究對象，通過MTTlY,色、平板克隆集落

8、形成、transwelld,室侵襲遷移實驗以及裸鼠體