中華補(bǔ)血草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及補(bǔ)血草nkcc基因沉默的功能研究

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1、山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文中華補(bǔ)血草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及補(bǔ)血草NKCC基因沉默的功能研究姓名：張霞申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：趙彥修;張慧20080420獨(dú)創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得(注：如沒有其他需要特別聲明的，本欄可空)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者筘名：張霞導(dǎo)師簽字：學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書遺云鐘本學(xué)

2、位論文作者完全了解堂撞有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)—堂圭L可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)讎文儲(chǔ)躲張餒新搏交易糾簽字日期：2008年4月20同簽字日期：2008年4月20R山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文中華補(bǔ)血草遺傳撇系的龜芷及補(bǔ)血草艘基因沉默的功能研究張霞(山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250014)中文摘要許多環(huán)境因子會(huì)對(duì)植物的生長產(chǎn)生脅迫影響，是植物生長的脅迫因子。植物生長

3、發(fā)育過程中不可避免地會(huì)受到(環(huán)境)脅迫因子的影響。重度的脅迫會(huì)對(duì)植物的生長發(fā)育造成傷害；在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中則會(huì)降低農(nóng)作物的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。研究植物對(duì)脅迫的應(yīng)答及調(diào)控機(jī)理對(duì)降低脅迫的不利影響，指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有積極的意義。高鹽是常見的脅迫因子，土壤鹽漬化會(huì)嚴(yán)重抑制植物的生長和發(fā)育，影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。鹽對(duì)植物造成的脅迫同植物的離子運(yùn)輸密切相關(guān)，因此，研究植物的離子運(yùn)輸對(duì)理解植物耐鹽的機(jī)理及調(diào)節(jié)至關(guān)重要。動(dòng)物中的研究表明，NKcC是一類與鹽腺泌鹽功能密切相關(guān)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)，它同C1．-．Channel(氯離子通道)以及該基因家族的其它成員的編碼產(chǎn)物如KCC、NCC協(xié)同配合對(duì)動(dòng)

4、物鹽腺的泌鹽功能至關(guān)重要。在植物中，泌鹽是鹽生植物耐鹽的一種重要策略，但分子水平上對(duì)植物泌鹽的機(jī)理還了解甚少。因此，在植物，特別是在鹽生植物中，M(CC的研究對(duì)理解植物的泌鹽機(jī)理，了解動(dòng)植物中類似基因的功能具有一定的意義。中華補(bǔ)血革仁i州徹f“ms加繃sPKuntzc)為白花丹科(Pmm6昭Pn口c∞0補(bǔ)血草屬(三f研鯽m朋)多年生泌鹽草本植物。它具有特殊的泌鹽結(jié)構(gòu)一鹽腺，可將吸收到體內(nèi)的鹽離子排到體外，從而避免鹽分脅迫的傷害。中華補(bǔ)血草可以使鹽土脫鹽，改善土壤結(jié)構(gòu)，被譽(yù)為鹽堿地改造的”先鋒植物”。中華補(bǔ)血草是一種鮮切花栽培種，又是理想的天然干花材料，俗稱“星辰花”、勿忘我

5、”，在世界許多地區(qū)商業(yè)栽培。但中華補(bǔ)血草具有大量的不孕枝，同時(shí)又具有同型雜交不孕的特性，種子結(jié)實(shí)少，限制了專業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展，可以考慮利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來改良補(bǔ)血草品種。通過對(duì)補(bǔ)血草赫腺泌鹽過程和泌鹽機(jī)理的研究，鹽腺的形態(tài)構(gòu)造及其泌鹽過程和規(guī)律已有初步了解，但是中華補(bǔ)血草之所以具有較高抗鹽能力的關(guān)鍵因子是什么?至今還不太清楚。要研究該問題，基因敲除或RNAi技術(shù)無疑是強(qiáng)有力的工具，這就需要建立中華補(bǔ)血草的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究是在已建立的中華補(bǔ)血草再生體系的基礎(chǔ)上，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的中華補(bǔ)血草葉圓盤轉(zhuǎn)化體系中各相關(guān)影響因子進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，研究發(fā)現(xiàn)：山東師范人學(xué)碩士學(xué)位論文1)補(bǔ)血草

6、葉片對(duì)卡那霉素是敏感的。50m∥L的卡那霉素濃度作為補(bǔ)血草葉片轉(zhuǎn)化受體的篩選濃度比較適宜。2)頭孢曲松鈉和特美汀的抑菌效果不同。400IIl∥L的特美汀就能有效抑菌，三到四周轉(zhuǎn)接一次即·叮，且不影響外植體的分化，既減少了工作量，又提高了轉(zhuǎn)化率。3)接種EHAl05菌株時(shí)，補(bǔ)血草的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于接種LBA4404和GV3101菌株，可達(dá)15％。4)對(duì)于長至llcm左右的補(bǔ)血草無菌苗葉片，侵染時(shí)重懸菌液濃度以O(shè)D600=0．7．1．O為宜，轉(zhuǎn)化率可達(dá)15％。513d和4d共培養(yǎng)天數(shù)的處理對(duì)補(bǔ)血草轉(zhuǎn)化率的影響不大，以4d的共培養(yǎng)效果稍好，有15％的外植體可以分化出芽。本試驗(yàn)中構(gòu)建

7、了^wcc基因的沉默載體，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)中華補(bǔ)血草的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并得到了分子證據(jù)。轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測(cè)如下：1)各轉(zhuǎn)基因株系中，均能通過PcR擴(kuò)增出nptII基因795bp的特異性條帶，初步表明印tII外源基因已整合到受體植物基因組中。21Southcm雜交結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)外源基因已整合到補(bǔ)血草的基因組中。31RealtimePcR結(jié)果顯示，隨機(jī)選取的叫個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的Ⅳ嬲c轉(zhuǎn)錄水平會(huì)發(fā)生不同程度的下降。進(jìn)一步說明A0rCC基因的反向重復(fù)片段整合到奉卜血草的基因組后已正常轉(zhuǎn)錄，并引起了M犯CRNA的降