中華補血草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及補血草nkcc基因沉默的功能研究

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1、山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文中華補血草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及補血草NKCC基因沉默的功能研究姓名：張霞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：趙彥修;張慧20080420獨創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得(注：如沒有其他需要特別聲明的，本欄可空)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者筘名：張霞導(dǎo)師簽字：學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書遺云鐘本學(xué)

2、位論文作者完全了解堂撞有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)—堂圭L可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)讎文儲躲張餒新搏交易糾簽字日期：2008年4月20同簽字日期：2008年4月20R山東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文中華補血草遺傳撇系的龜芷及補血草艘基因沉默的功能研究張霞(山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟南，250014)中文摘要許多環(huán)境因子會對植物的生長產(chǎn)生脅迫影響，是植物生長的脅迫因子。植物生長

3、發(fā)育過程中不可避免地會受到(環(huán)境)脅迫因子的影響。重度的脅迫會對植物的生長發(fā)育造成傷害；在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中則會降低農(nóng)作物的產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟效益。研究植物對脅迫的應(yīng)答及調(diào)控機理對降低脅迫的不利影響，指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有積極的意義。高鹽是常見的脅迫因子，土壤鹽漬化會嚴重抑制植物的生長和發(fā)育，影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。鹽對植物造成的脅迫同植物的離子運輸密切相關(guān)，因此，研究植物的離子運輸對理解植物耐鹽的機理及調(diào)節(jié)至關(guān)重要。動物中的研究表明，NKcC是一類與鹽腺泌鹽功能密切相關(guān)的離子轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)，它同C1．-．Channel(氯離子通道)以及該基因家族的其它成員的編碼產(chǎn)物如KCC、NCC協(xié)同配合對動

4、物鹽腺的泌鹽功能至關(guān)重要。在植物中，泌鹽是鹽生植物耐鹽的一種重要策略，但分子水平上對植物泌鹽的機理還了解甚少。因此，在植物，特別是在鹽生植物中，M(CC的研究對理解植物的泌鹽機理，了解動植物中類似基因的功能具有一定的意義。中華補血革仁i州徹f“ms加繃sPKuntzc)為白花丹科(Pmm6昭Pn口c∞0補血草屬(三f研鯽m朋)多年生泌鹽草本植物。它具有特殊的泌鹽結(jié)構(gòu)一鹽腺，可將吸收到體內(nèi)的鹽離子排到體外，從而避免鹽分脅迫的傷害。中華補血草可以使鹽土脫鹽，改善土壤結(jié)構(gòu)，被譽為鹽堿地改造的”先鋒植物”。中華補血草是一種鮮切花栽培種，又是理想的天然干花材料，俗稱“星辰花”、勿忘我

5、”，在世界許多地區(qū)商業(yè)栽培。但中華補血草具有大量的不孕枝，同時又具有同型雜交不孕的特性，種子結(jié)實少，限制了專業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展，可以考慮利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來改良補血草品種。通過對補血草赫腺泌鹽過程和泌鹽機理的研究，鹽腺的形態(tài)構(gòu)造及其泌鹽過程和規(guī)律已有初步了解，但是中華補血草之所以具有較高抗鹽能力的關(guān)鍵因子是什么?至今還不太清楚。要研究該問題，基因敲除或RNAi技術(shù)無疑是強有力的工具，這就需要建立中華補血草的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究是在已建立的中華補血草再生體系的基礎(chǔ)上，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的中華補血草葉圓盤轉(zhuǎn)化體系中各相關(guān)影響因子進行了實驗研究，研究發(fā)現(xiàn)：山東師范人學(xué)碩士學(xué)位論文1)補血草

6、葉片對卡那霉素是敏感的。50m∥L的卡那霉素濃度作為補血草葉片轉(zhuǎn)化受體的篩選濃度比較適宜。2)頭孢曲松鈉和特美汀的抑菌效果不同。400IIl∥L的特美汀就能有效抑菌，三到四周轉(zhuǎn)接一次即·叮，且不影響外植體的分化，既減少了工作量，又提高了轉(zhuǎn)化率。3)接種EHAl05菌株時，補血草的轉(zhuǎn)化率遠遠高于接種LBA4404和GV3101菌株，可達15％。4)對于長至llcm左右的補血草無菌苗葉片，侵染時重懸菌液濃度以O(shè)D600=0．7．1．O為宜，轉(zhuǎn)化率可達15％。513d和4d共培養(yǎng)天數(shù)的處理對補血草轉(zhuǎn)化率的影響不大，以4d的共培養(yǎng)效果稍好，有15％的外植體可以分化出芽。本試驗中構(gòu)建

7、了^wcc基因的沉默載體，并實現(xiàn)了對中華補血草的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并得到了分子證據(jù)。轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測如下：1)各轉(zhuǎn)基因株系中，均能通過PcR擴增出nptII基因795bp的特異性條帶，初步表明印tII外源基因已整合到受體植物基因組中。21Southcm雜交結(jié)果進一步證實外源基因已整合到補血草的基因組中。31RealtimePcR結(jié)果顯示，隨機選取的叫個轉(zhuǎn)基因株系的Ⅳ嬲c轉(zhuǎn)錄水平會發(fā)生不同程度的下降。進一步說明A0rCC基因的反向重復(fù)片段整合到奉卜血草的基因組后已正常轉(zhuǎn)錄，并引起了M犯CRNA的降