異丙酚對子宮內(nèi)膜癌細胞的影響及其作用機制研究

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1、分類號：164.1密級：公開學校代碼：11065學號：y0115130149專業(yè)博士學位論文異丙酚對子宮內(nèi)膜癌細胞的影響及其作用機制研究作者姓名杜青指導教師王士雷教授專業(yè)領域麻醉學培養(yǎng)單位臨床醫(yī)學院答辯日期2018年5月12日異丙酚對子宮內(nèi)膜癌細胞的影響及其作用機制研究摘要目的：異丙酚（2,6-diisopropylphenol,propofol）是一種常見的靜脈注射麻醉劑，而且異丙酚在各種癌癥中也具有明顯的抗腫瘤功能。性別決定區(qū)相關高遷移率族盒（Sex-determiningregionY-box,Sox）4不僅可以參與胰腺的發(fā)育、胚胎心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及

2、淋巴細胞發(fā)展和分化等生理生化反應，而且在腫瘤的形成、發(fā)育和增殖過程中也具有重要的作用。但是，異丙酚對于子宮內(nèi)膜癌（Endometrialcancer）和對Sox4的研究較少，因此本文通過研究異丙酚對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，意在揭示異丙酚在子宮內(nèi)膜癌細胞中的作用及其潛在的分子機制。方法：1為了研究異丙酚對子宮內(nèi)膜癌的影響，我們?nèi)?shù)生長期的Ishikawa細胞和HEC-50細胞，以500個/孔的密度接種到6孔板中，采用2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml等不同濃度的異丙酚處理人子宮內(nèi)膜癌細胞株，培養(yǎng)14天后，然后采用集落形成試驗檢測異丙

3、酚對人子宮內(nèi)膜癌細胞株克隆能力的影響。將細胞接種到6孔板（1×105個/孔的密度）上培養(yǎng)48小時，采用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測Ishikawa細胞的凋亡率。用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌細胞，采用8-μm孔隙聚碳酸酯過濾器的24孔侵襲小室檢測孵育12小時后細胞的遷移能力、將基質(zhì)膠用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋，然后采用8-μm孔隙聚碳酸酯過濾器的24孔侵襲小室檢測孵育12小時后細胞的侵襲能力。同時采用蛋白免疫印跡法檢測細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑p21、細胞周期素E1（CyclinE1）和CyclinD1等細胞周期相關

4、因子，Bid、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2associatedX,Bax）和活化半胱天冬酶3（activecaspase3）等細胞凋亡相關蛋白以及基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrixmetallopeptidase9,MMP9）和MMP2等細胞遷移相關蛋白表達水平。并且為了進一步檢測異丙酚對Ishikawa細胞增殖的影響，我們采用4μg/ml的異丙酚連續(xù)處理Ishikawa細胞4天，并通過采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumBrom

5、ide,MTT）比色法檢測Ishikawa細胞的活性和流式細胞儀檢測Ishikawa細胞周期變化情況。2為了研究Sox4對子宮內(nèi)膜癌細胞的作用，我們采用實時熒光定量PCR（Quantitativereal-timePCR,qRT-PCR）檢測了不同濃度的異丙酚（2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml）處理下Ishikawa細胞中Sox4的mRNA表達水平。然后按照制造商說明書采用脂質(zhì)體2000試劑，將pcDNA3.1-Sox4（Sox4過表達載體）、si-Sox4（特異性抑制ISox4的短發(fā)夾RNA）以及si-NC（si-Sox4的陰性對照）轉染到生長良好

6、的Ishikawa細胞。共分為3組:異丙酚組（4μg/ml），Ishikawa細胞用4μg/ml的異丙酚處理24小時；異丙酚+pcDNA3.1-Sox4組，Ishikawa細胞轉染pcDNA3.1-Sox4然后用4μg/ml的異丙酚處理24小時；異丙酚+si-Sox4組：Ishikawa細胞轉染si-Sox4然后用4μg/ml的異丙酚處理24小時。采用蛋白免疫印跡法檢測Sox4過表達或Sox4沉默表達的細胞中的Sox4蛋白表達水平。同時通過免疫組織化學檢測4μg/ml的異丙酚處理下pcDNA3.1-Sox4組、si-NC組及其相應對照組細胞中Ki67+細胞的

7、數(shù)目。采用4μg/ml的異丙酚處理pcDNA3.1-Sox4轉染細胞，然后通過BALB/c-nu裸鼠（6周齡）成瘤實驗檢測異丙酚和Sox4對Ishikawa細胞的影響。采用注射器將0.2ml細胞懸浮液注射到小鼠兩側的腹部，使接種細胞總數(shù)為1×109個/只。正常飼養(yǎng)4周后，解剖并獲得腫瘤。觀察稱量腫瘤的大小和重量，并拍照對比。3為了研究異丙酚在子宮內(nèi)膜癌的可能的信號通路，我們首先采用蛋白免疫印跡法分別檢測不同濃度的異丙酚（2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml）條件下Ishikawa細胞的核β-catenin和總β-catenin的表達水平。進而，我們采用蛋

8、白免疫印跡法分別檢測異丙酚在不同處理時間（0、2、4