異丙酚對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制研究

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1、分類號(hào)：164.1密級(jí)：公開學(xué)校代碼：11065學(xué)號(hào)：y0115130149專業(yè)博士學(xué)位論文異丙酚對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制研究作者姓名杜青指導(dǎo)教師王士雷教授專業(yè)領(lǐng)域麻醉學(xué)培養(yǎng)單位臨床醫(yī)學(xué)院答辯日期2018年5月12日異丙酚對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制研究摘要目的：異丙酚（2,6-diisopropylphenol,propofol）是一種常見的靜脈注射麻醉劑，而且異丙酚在各種癌癥中也具有明顯的抗腫瘤功能。性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族盒（Sex-determiningregionY-box,Sox）4不僅可以參與胰腺的發(fā)育、胚胎心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及

2、淋巴細(xì)胞發(fā)展和分化等生理生化反應(yīng)，而且在腫瘤的形成、發(fā)育和增殖過程中也具有重要的作用。但是，異丙酚對(duì)于子宮內(nèi)膜癌（Endometrialcancer）和對(duì)Sox4的研究較少，因此本文通過研究異丙酚對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，意在揭示異丙酚在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的作用及其潛在的分子機(jī)制。方法：1為了研究異丙酚對(duì)子宮內(nèi)膜癌的影響，我們?nèi)?duì)數(shù)生長期的Ishikawa細(xì)胞和HEC-50細(xì)胞，以500個(gè)/孔的密度接種到6孔板中，采用2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml等不同濃度的異丙酚處理人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株，培養(yǎng)14天后，然后采用集落形成試驗(yàn)檢測(cè)異丙

3、酚對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株克隆能力的影響。將細(xì)胞接種到6孔板（1×105個(gè)/孔的密度）上培養(yǎng)48小時(shí)，采用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞的凋亡率。用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，采用8-μm孔隙聚碳酸酯過濾器的24孔侵襲小室檢測(cè)孵育12小時(shí)后細(xì)胞的遷移能力、將基質(zhì)膠用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋，然后采用8-μm孔隙聚碳酸酯過濾器的24孔侵襲小室檢測(cè)孵育12小時(shí)后細(xì)胞的侵襲能力。同時(shí)采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑p21、細(xì)胞周期素E1（CyclinE1）和CyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)

4、因子，Bid、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2associatedX,Bax）和活化半胱天冬酶3（activecaspase3）等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrixmetallopeptidase9,MMP9）和MMP2等細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)水平。并且為了進(jìn)一步檢測(cè)異丙酚對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響，我們采用4μg/ml的異丙酚連續(xù)處理Ishikawa細(xì)胞4天，并通過采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumBrom

5、ide,MTT）比色法檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞的活性和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞周期變化情況。2為了研究Sox4對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitativereal-timePCR,qRT-PCR）檢測(cè)了不同濃度的異丙酚（2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml）處理下Ishikawa細(xì)胞中Sox4的mRNA表達(dá)水平。然后按照制造商說明書采用脂質(zhì)體2000試劑，將pcDNA3.1-Sox4（Sox4過表達(dá)載體）、si-Sox4（特異性抑制ISox4的短發(fā)夾RNA）以及si-NC（si-Sox4的陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)染到生長良好

6、的Ishikawa細(xì)胞。共分為3組:異丙酚組（4μg/ml），Ishikawa細(xì)胞用4μg/ml的異丙酚處理24小時(shí)；異丙酚+pcDNA3.1-Sox4組，Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Sox4然后用4μg/ml的異丙酚處理24小時(shí)；異丙酚+si-Sox4組：Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Sox4然后用4μg/ml的異丙酚處理24小時(shí)。采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)Sox4過表達(dá)或Sox4沉默表達(dá)的細(xì)胞中的Sox4蛋白表達(dá)水平。同時(shí)通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)4μg/ml的異丙酚處理下pcDNA3.1-Sox4組、si-NC組及其相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞中Ki67+細(xì)胞的

7、數(shù)目。采用4μg/ml的異丙酚處理pcDNA3.1-Sox4轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后通過BALB/c-nu裸鼠（6周齡）成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)異丙酚和Sox4對(duì)Ishikawa細(xì)胞的影響。采用注射器將0.2ml細(xì)胞懸浮液注射到小鼠兩側(cè)的腹部，使接種細(xì)胞總數(shù)為1×109個(gè)/只。正常飼養(yǎng)4周后，解剖并獲得腫瘤。觀察稱量腫瘤的大小和重量，并拍照對(duì)比。3為了研究異丙酚在子宮內(nèi)膜癌的可能的信號(hào)通路，我們首先采用蛋白免疫印跡法分別檢測(cè)不同濃度的異丙酚（2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml）條件下Ishikawa細(xì)胞的核β-catenin和總β-catenin的表達(dá)水平。進(jìn)而，我們采用蛋

8、白免疫印跡法分別檢測(cè)異丙酚在不同處理時(shí)間（0、2、4