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1、目錄1刪燃Y2337615中文摘要??????????????????????????1英文摘要??????????????????????????4研究論文新生大鼠骨骼肌肌源性干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定前言??????????????????????????8日{(diào)』吾????????“????????????一“”“?“?8材料與方法??????OOe0???????????????8結(jié)果??????????????????????????13附圖?????????····??????··?··???????·16附表?????
2、?????????????????????25討論??????????????????????????27結(jié)論??????????????????????????32參考文獻(xiàn)????????????????????????37-綜述骨骼肌肌源干細(xì)胞的特性及應(yīng)用的研究進(jìn)展????????35致謝???????????????????????????47個(gè)人簡(jiǎn)歷??????????????????????????48中文摘要新生大鼠骨骼肌肌源性干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定摘要目的：肌源性干細(xì)胞(musclederived．stemcel
3、ls，ⅧSCs)移植治療壓力性尿失禁(SU)的研究深受關(guān)注，傳統(tǒng)的治療方法長(zhǎng)期療效不理想且并發(fā)癥多，隨干細(xì)胞研究的深入，干細(xì)胞移植成為肌肉組織損傷修復(fù)的一種重要手段，同時(shí)也為SUI的根本治療帶來(lái)希望。其中MDSCs倍受關(guān)注，它是肌肉中一種高度未分化的多潛能干細(xì)胞，具有體外分裂增殖快、自我更新、多向分化潛能和移植后存活率高等特點(diǎn)。并且取材資源豐富，操作方便，安全性高，是一種理想的種子細(xì)胞。由于肌肉組織中MDSCs數(shù)量少，所以MDSCs的分離和體外培養(yǎng)是進(jìn)行移植的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良酶消化法和差速貼壁法分離純化出MDSCs，通過(guò)細(xì)胞免疫組
4、織化學(xué)染色進(jìn)行鑒定，并對(duì)其體外培養(yǎng)進(jìn)行密切觀察，掌握穩(wěn)定的分離純化和培養(yǎng)方法，為將來(lái)移植治療SUI提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1骨骼肌細(xì)胞的消化分離：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)新生SD(Sprayue．Dawley)大鼠，雌雄不限。75％酒精浸泡窒息處死后，取下四肢骨骼肌并剪成碎塊(約lmm3)，PBS緩沖液吹打沖洗，靜置后去除上清液，加入約2倍體積的混合酶(2．4u／mlDispaseII、O．5％I型膠原酶，2．5mmol／LCaCl2)，37℃水浴箱消化約l小時(shí)，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，過(guò)濾后離心棄上層液，重懸細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)(37℃，5％C
5、02)。2MDSCs的分離、純化和培養(yǎng)：培養(yǎng)2小時(shí)后貼壁細(xì)胞記為PPl，將上層液中未貼壁的細(xì)胞吸出后繼續(xù)培養(yǎng)。24小時(shí)后，貼壁細(xì)胞記為PP2。每24小時(shí)進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6。PP6培養(yǎng)3天后換液，每2～3天換液1次，待70～80％融合后傳代培養(yǎng)。用0．25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入胎牛血清終止消化，按1：2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。3MDSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：取MDSCs傳代培養(yǎng)的一代、四代和七代細(xì)胞，0．25％胰酶消化后，以3×104個(gè)／ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每目隨機(jī)選取3孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，共記錄8日，取平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)
6、曲線。中文摘要4MTT比色法觀察不同接種密度對(duì)MDSCs生長(zhǎng)的影響：取MDSCs傳代細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度分別為2、4、6、8、10、12、15x105個(gè)／ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入20ulMTT(5mg／m1)，37℃避光培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清液，每孔加入100ul二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘使結(jié)晶物完全溶解，在490nm處檢測(cè)吸光度值。5MDSCs的鑒定：對(duì)獲取的MDSCs(PP6)以及MDSCs傳一代、四代、七代進(jìn)行Desmin、Sca-1抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對(duì)PPI～PP6進(jìn)行Desmin免疫細(xì)胞化
7、學(xué)染色，以成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照，在顯微鏡下觀察，以胞膜和／或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性，每組選取不同的視野進(jìn)行計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSSl3．0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1MDSCs的消化、分離、純化和細(xì)胞形態(tài)骨骼肌經(jīng)過(guò)混合酶消化后得到肌纖維碎片、骨骼肌細(xì)胞、血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等的混合物，用差速貼壁法將快速貼壁細(xì)胞與慢速貼壁細(xì)胞逐步分離，便可獲得MDSCs。PPl、PP2以成纖維細(xì)胞為主，細(xì)胞數(shù)量多，貼壁迅速，增殖快，5天左右完全融合；P
8、P3、PP4以肌細(xì)胞為主，數(shù)量減少，增殖較快，1周左右完全融合；PP6貼壁的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，多為小圓形或梭形，體積較小，折光性好，增殖緩慢，另有少量懸浮的細(xì)胞。培養(yǎng)72小時(shí)后細(xì)胞數(shù)量增多，呈現(xiàn)梭形或紡錘形，有小克隆團(tuán)形
