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《新生大鼠骨骼肌肌源性干細胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、目錄1刪燃Y2337615中文摘要??????????????????????????1英文摘要??????????????????????????4研究論文新生大鼠骨骼肌肌源性干細胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定前言??????????????????????????8日{(diào)』吾????????“????????????一“”“?“?8材料與方法??????OOe0???????????????8結(jié)果??????????????????????????13附圖?????????····??????··?··???????·16附表?????
2、?????????????????????25討論??????????????????????????27結(jié)論??????????????????????????32參考文獻????????????????????????37-綜述骨骼肌肌源干細胞的特性及應(yīng)用的研究進展????????35致謝???????????????????????????47個人簡歷??????????????????????????48中文摘要新生大鼠骨骼肌肌源性干細胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定摘要目的：肌源性干細胞(musclederived．stemcel
3、ls，ⅧSCs)移植治療壓力性尿失禁(SU)的研究深受關(guān)注，傳統(tǒng)的治療方法長期療效不理想且并發(fā)癥多，隨干細胞研究的深入，干細胞移植成為肌肉組織損傷修復(fù)的一種重要手段，同時也為SUI的根本治療帶來希望。其中MDSCs倍受關(guān)注，它是肌肉中一種高度未分化的多潛能干細胞，具有體外分裂增殖快、自我更新、多向分化潛能和移植后存活率高等特點。并且取材資源豐富，操作方便，安全性高，是一種理想的種子細胞。由于肌肉組織中MDSCs數(shù)量少，所以MDSCs的分離和體外培養(yǎng)是進行移植的關(guān)鍵。本實驗運用改良酶消化法和差速貼壁法分離純化出MDSCs，通過細胞免疫組
4、織化學(xué)染色進行鑒定，并對其體外培養(yǎng)進行密切觀察，掌握穩(wěn)定的分離純化和培養(yǎng)方法，為將來移植治療SUI提供重要的實驗依據(jù)。方法：1骨骼肌細胞的消化分離：實驗動物為清潔級新生SD(Sprayue．Dawley)大鼠，雌雄不限。75％酒精浸泡窒息處死后，取下四肢骨骼肌并剪成碎塊(約lmm3)，PBS緩沖液吹打沖洗，靜置后去除上清液，加入約2倍體積的混合酶(2．4u／mlDispaseII、O．5％I型膠原酶，2．5mmol／LCaCl2)，37℃水浴箱消化約l小時，加入生長培養(yǎng)基終止消化，過濾后離心棄上層液，重懸細胞后進行培養(yǎng)(37℃，5％C
5、02)。2MDSCs的分離、純化和培養(yǎng)：培養(yǎng)2小時后貼壁細胞記為PPl，將上層液中未貼壁的細胞吸出后繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后，貼壁細胞記為PP2。每24小時進行差速貼壁培養(yǎng)，直到獲得PP6。PP6培養(yǎng)3天后換液，每2～3天換液1次，待70～80％融合后傳代培養(yǎng)。用0．25％胰蛋白酶消化細胞，加入胎牛血清終止消化，按1：2的比例進行傳代培養(yǎng)。3MDSCs生長曲線的測定：取MDSCs傳代培養(yǎng)的一代、四代和七代細胞，0．25％胰酶消化后，以3×104個／ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，每目隨機選取3孔進行細胞計數(shù)，共記錄8日，取平均值繪制細胞生長
6、曲線。中文摘要4MTT比色法觀察不同接種密度對MDSCs生長的影響：取MDSCs傳代細胞，調(diào)節(jié)細胞密度分別為2、4、6、8、10、12、15x105個／ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48小時后，每孔加入20ulMTT(5mg／m1)，37℃避光培養(yǎng)4小時后棄上清液，每孔加入100ul二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘使結(jié)晶物完全溶解，在490nm處檢測吸光度值。5MDSCs的鑒定：對獲取的MDSCs(PP6)以及MDSCs傳一代、四代、七代進行Desmin、Sca-1抗體免疫細胞化學(xué)染色，對PPI～PP6進行Desmin免疫細胞化
7、學(xué)染色，以成纖維細胞作為陰性對照，在顯微鏡下觀察，以胞膜和／或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性，每組選取不同的視野進行計算陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比。6統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSSl3．0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0．05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1MDSCs的消化、分離、純化和細胞形態(tài)骨骼肌經(jīng)過混合酶消化后得到肌纖維碎片、骨骼肌細胞、血細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等的混合物，用差速貼壁法將快速貼壁細胞與慢速貼壁細胞逐步分離，便可獲得MDSCs。PPl、PP2以成纖維細胞為主，細胞數(shù)量多，貼壁迅速，增殖快，5天左右完全融合；P
8、P3、PP4以肌細胞為主，數(shù)量減少，增殖較快，1周左右完全融合；PP6貼壁的細胞數(shù)量明顯減少，多為小圓形或梭形，體積較小，折光性好，增殖緩慢，另有少量懸浮的細胞。培養(yǎng)72小時后細胞數(shù)量增多，呈現(xiàn)梭形或紡錘形，有小克隆團形
