棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中活性肽分離純化、分子克隆以及結(jié)構(gòu)和功能的研究

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1、中文摘要棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中活性肽分離純化、分子克隆以及結(jié)構(gòu)與功能的研究摘要兩棲類是一類具有生態(tài)、科研、經(jīng)濟(jì)、以及文化價值的自然資源。同時，兩棲類皮膚也是具有很大開發(fā)潛力的生物資源寶庫。兩棲類的皮膚中含有種類繁多、功能復(fù)雜的生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可用來抵御有害環(huán)境因子的侵襲。存在于兩棲類皮膚分泌液中的生物洚】生成分引起了世界上研究人員極大的關(guān)注。迄今為止，已分離鑒定出許多具有各種生物活性的蛋白以及多肽。中國擁有豐富的兩棲類資源，在284個種(亞種)中2／3是特有種，在生物活性物質(zhì)開發(fā)方面具有

2、極大的潛力。我們收集了三種兩棲類動物：棕點(diǎn)湍蛙(Amolopsloloensis)、無指盤臭蛙(Ranagrahami)以及中國林蛙(Ranachensinensis)，并對這三種兩棲類的皮膚分泌液進(jìn)行了一系列的生物活性篩選：1．胰蛋白酶水解活性檢測；2．胰蛋白酶抑制劑活性檢測；3．抗茵活性檢測；4．溶血、出血及血漿凝固活性檢測；5．血小板聚集活性檢測；6．血小板聚集抑制活性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1．三種兩棲類的皮膚分泌液都不具有胰蛋白酶水解活性；2．棕點(diǎn)湍蛙以及無指盤臭蛙皮膚分泌液具有較強(qiáng)的胰蛋白酶

3、抑制劑活·『生；3．棕點(diǎn)湍蛙以及無指盤臭蛙皮膚分泌液具有較強(qiáng)的抗茵活性；4．三種兩棲類的皮膚分泌液不具備出血活性，但是顯示較弱的溶血活·瞄以及抗血漿凝固活性。5．三種兩棲類的皮膚分泌液都不具有促進(jìn)血小板聚集活性；6．棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液具有抑制血小板聚集活性。以來源于單個棕點(diǎn)湍蛙(Amolopsloloensis)個體皮膚中提取的mRNA為材料，我們建立了棕點(diǎn)湍蛙皮膚cDNA文庫，得到大約為lxl06個獨(dú)立的克隆。通過生物化學(xué)，分子生物學(xué)手段和研究方法，在棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中得到一系列的皮膚活性多

4、肽以及cDNA序列，其中包括抗茵肽，緩激肽，胸腺肽等，并對其結(jié)構(gòu)，功能進(jìn)行了相應(yīng)的研究。通過兩步分離純化過程：SephadexG一50凝膠過濾和反相高壓液相層析(RP．HPLC)，我們從棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌物中分離純化得到3個、2類別的抗茵肽，并命名為amolopin．1a，lb和1c。借助于質(zhì)譜，我們得到這三個抗茵肽的分子量分別為2665．3、2663．7乖1626．0道爾頓。這兩類抗菌肽都含有多個堿性氨基酸而帶有正電荷，這是首次從湍蛙屬中分離純化得到的抗菌肽，進(jìn)一步豐富了兩棲類抗茵肽類群。我們所

5、得到的3個抗茵肽，其中2個由24個氨基酸殘基組成，具有半胱氨酸組成的二硫鍵，形成Ranabox。通過Genbank進(jìn)行blast，發(fā)現(xiàn)該類抗菌肽與來源于Ranaesculenta的brevinin一1E具有87％和79％的同源性。另外一個抗茵肽由16個氨基酸殘基組成，不合棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌液中活性肽分離純化、分子克隆以及結(jié)構(gòu)與功能的研究有半胱氨酸組成的二硫鍵，可以形成a．螺旋。這類抗菌肽和來源于Ranatemporaria的Temporin．F具有50％的同源性。根據(jù)一系列的活性檢測，我們發(fā)現(xiàn)兩類

6、amolopinj％茵肽在一些活性上具有很大的差異。amolopin．1b具有很強(qiáng)的溶血活性和較弱的肥大細(xì)胞脫粒肽活性，而amolopin一2a則相反，但是兩者都有較強(qiáng)的促進(jìn)肥大細(xì)胞中組胺釋放的活性。amolopin．1b和2a都具有一定的抗腫瘤活性。根據(jù)編碼盈z／'taesculenta中brevinin．1E前體保守的5’端核苷酸區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在棕點(diǎn)湍蛙皮膚cDNA文庫中篩選編碼amolo口in抗茵肽的cDNA序列的單克隆。對所得到的陽性克隆進(jìn)行測序，我們篩選到編碼不同amolopin抗菌肽

7、前體的不同的cDNA序列14條，這14條cDNA序列最終編碼3類、8條不同的am010pin抗菌肽。我們將這三類抗茵肽命名為amolopin．1，2，3系列。通過兩步分離純化過程：sephadexG．50凝膠過濾和反相高壓液相層析(RP．HPLC)，從棕點(diǎn)湍蛙皮膚分泌物中分離純化得到一種具有12個氨基酸的緩激膚，我們將該緩激肽命名為amolopkinin。該緩激肽和來源于Ranarugosa的ranakininR具有76％的同源性，具有增強(qiáng)小鼠回腸肌收縮的作用。amolopkinin在N端部分具

8、有插入片段APv，這是首次從湍蛙屬得到的緩激肽以及cDNA序列。通過隨機(jī)篩選棕點(diǎn)湍蛙cDNA文庫，我們得到了棕點(diǎn)湍蛙胸腺肽一D4的cDNA全序列，并命名為aT-D4。該cDNA序列由698個核苷酸組成，由其開放閱讀框推導(dǎo)出來的胸腺肽組成為44個氨基酸，通過Genbank進(jìn)行blast發(fā)現(xiàn)該胸腺肽和來源于娩nopuslaev／s的thymosinbeta4有90％的同源性。這是首次從兩棲類得到來源于皮膚的胸腺肽．p4cDNA全序列。關(guān)鍵詞：棕點(diǎn)湍蛙；抗菌肽；緩激肽；胸腺肽一D4Ⅱ英文摘要PURIF