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《重組維氏氣單胞菌鞭毛蛋白flaa對鯉tlr5m信號通路的調(diào)節(jié)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、中文摘要重組維氏氣單胞菌鞭毛蛋白FlaA對鯉TLR5M信號通路的調(diào)節(jié)鯉魚是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占重要地位。隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的不斷擴大，病害問題日益嚴重，由細菌引起的疾病嚴重制約淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。維氏氣單胞菌（Aeromonasveronii）是水生環(huán)境中普遍存在的一種致病菌，是引起魚類敗血癥、魚體潰瘍綜合征的主要致病菌，同時該菌還能引起人的感染而發(fā)生腹瀉或食物中毒，嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展以及公共衛(wèi)生安全。維氏氣單胞菌的致病性與其產(chǎn)生的多種毒力因子息息相關。脂多糖、腸毒素、外膜蛋白和S層蛋白作為重要的毒力因子國外已深入
2、研究。鞭毛作為細菌重要的運動器官，在與其他微生物的競爭中發(fā)揮重要作用，然而鞭毛在細菌粘附、生物被膜形成以及幾種病原菌定植中同樣起關鍵作用。鞭毛作為細菌重要的毒力因子，能有效激活天然免疫應答。鞭毛蛋白作為細菌鞭毛的主要組成部分，是TLR5的配體，能與細胞表面的TLR5結合，通過MyD88（髓樣分化因子88）依賴途徑，迅速募集IRAKs(IL-1受體相關激酶)，并結合TRAF6(TNF受體相關因子6)，進而激活細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、誘導TNF-ɑ，IL-1β等前炎癥細胞因子的產(chǎn)生，從而介導機體對抗入侵異源病原體。本研究從肝臟腫大的病死鯉魚中分離細
3、菌CCA1301，采用生理生化方法、藥敏實驗抗菌分析，結合16SrDNA序列比對分析，鑒定該菌為維氏氣單胞菌。采用透射電鏡觀察菌體及鞭毛形態(tài)，并利用酸解法和離子交換層析法獲得高純度的天然鞭毛蛋白，為后續(xù)實驗操作奠定基礎。而后，根據(jù)GeneBank中公布的氣單胞菌基因序列，MegAlign進行多序列比對，在基因保守區(qū)設計特異性引物，成功克隆flaA基因，序列長度為915bp。將連入目的基因的pMD-18T克隆載體和原核表達載體pET-30a，進行質(zhì)粒雙酶切，成功構建重組表達載體pET-30a-flaA。將構建好的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3
4、）進行誘導表達，得到大小約為38kDa帶有His-tag的目的蛋白。采用鎳離子親和層析法純化蛋白，隨后免疫新西蘭大白兔，獲得鞭毛蛋白FlaA抗血清。Westernblot實驗證實FlaA抗血清不但能與重組鞭毛蛋白發(fā)生反應，而且也能與天然鞭毛蛋白發(fā)生反應，證明重組鞭毛蛋白FlaA具有較強的免疫原性，為進一步研究鞭毛蛋白的抗原性及免疫佐劑作用奠定基礎。最后，分別用維氏氣單胞菌、純化的天然鞭毛蛋白和重組鞭毛蛋白FlaA刺激鯉魚，分別經(jīng)12h和4h后，提取頭腎總RNA。利用熒光定量PCR方法分析III鯉魚頭腎TLR5M及其信號通路中TRAF6、TNF-α
5、表達量的差異情況。熒光定量PCR結果表明，與細菌、天然鞭毛蛋白刺激組相比，重組鞭毛蛋白FlaA同樣能使頭腎中TLR5M、TRAF6、TNF-α的表達量升高，說明重組鞭毛蛋白FlaA能夠調(diào)節(jié)鯉魚TLR5M及其信號通路中的相關因子，進而產(chǎn)生免疫應答反應。關鍵詞：維氏氣單胞菌；鞭毛蛋白；TLR5M；調(diào)節(jié)IVAbstractRecombinantAeromonasveroniiFlagellinFlaAMediateToll-likeReceptor5MSignalingPathwayofCommoncarpCommoncarpisthedominant
6、speciesoffreshwateraquacultureinourcountryandoccupiesanimportantpositionintheaquacultureindustry.Withthegrowingscaleoffarmingandbreedingdensity,BacterialInfectionshasbecomeanobviousobstaclerestrictingthedevelopmentofaquaculture.Aeromonasveronii,aubiquitouspathogenintheaquatic
7、environment,cancausesepticemiaandulcerativesyndromeoffreshwaterfishesandcausehumandiarrheaorfoodpoisoningafterinfection.Thispathogenposesaseriousthreattofishfarmingandhumanhealth.Aeromonasveroniicanproduceavarietyofpathogenicvirulencefactors,suchaslipopolysaccharide,enterotox
8、in,outermembraneproteinandS-layerprotein,whichhaveindepthstudyabroad
