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《重組維氏氣單胞菌鞭毛蛋白flaa對(duì)鯉tlr5m信號(hào)通路的調(diào)節(jié)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中文摘要重組維氏氣單胞菌鞭毛蛋白FlaA對(duì)鯉TLR5M信號(hào)通路的調(diào)節(jié)鯉魚是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占重要地位。隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，病害問題日益嚴(yán)重，由細(xì)菌引起的疾病嚴(yán)重制約淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。維氏氣單胞菌（Aeromonasveronii）是水生環(huán)境中普遍存在的一種致病菌，是引起魚類敗血癥、魚體潰瘍綜合征的主要致病菌，同時(shí)該菌還能引起人的感染而發(fā)生腹瀉或食物中毒，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展以及公共衛(wèi)生安全。維氏氣單胞菌的致病性與其產(chǎn)生的多種毒力因子息息相關(guān)。脂多糖、腸毒素、外膜蛋白和S層蛋白作為重要的毒力因子國外已深入
2、研究。鞭毛作為細(xì)菌重要的運(yùn)動(dòng)器官，在與其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)中發(fā)揮重要作用，然而鞭毛在細(xì)菌粘附、生物被膜形成以及幾種病原菌定植中同樣起關(guān)鍵作用。鞭毛作為細(xì)菌重要的毒力因子，能有效激活天然免疫應(yīng)答。鞭毛蛋白作為細(xì)菌鞭毛的主要組成部分，是TLR5的配體，能與細(xì)胞表面的TLR5結(jié)合，通過MyD88（髓樣分化因子88）依賴途徑，迅速募集IRAKs(IL-1受體相關(guān)激酶)，并結(jié)合TRAF6(TNF受體相關(guān)因子6)，進(jìn)而激活細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、誘導(dǎo)TNF-ɑ，IL-1β等前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)機(jī)體對(duì)抗入侵異源病原體。本研究從肝臟腫大的病死鯉魚中分離細(xì)
3、菌CCA1301，采用生理生化方法、藥敏實(shí)驗(yàn)抗菌分析，結(jié)合16SrDNA序列比對(duì)分析，鑒定該菌為維氏氣單胞菌。采用透射電鏡觀察菌體及鞭毛形態(tài)，并利用酸解法和離子交換層析法獲得高純度的天然鞭毛蛋白，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作奠定基礎(chǔ)。而后，根據(jù)GeneBank中公布的氣單胞菌基因序列，MegAlign進(jìn)行多序列比對(duì)，在基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，成功克隆flaA基因，序列長度為915bp。將連入目的基因的pMD-18T克隆載體和原核表達(dá)載體pET-30a，進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-30a-flaA。將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3
4、）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到大小約為38kDa帶有His-tag的目的蛋白。采用鎳離子親和層析法純化蛋白，隨后免疫新西蘭大白兔，獲得鞭毛蛋白FlaA抗血清。Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)FlaA抗血清不但能與重組鞭毛蛋白發(fā)生反應(yīng)，而且也能與天然鞭毛蛋白發(fā)生反應(yīng)，證明重組鞭毛蛋白FlaA具有較強(qiáng)的免疫原性，為進(jìn)一步研究鞭毛蛋白的抗原性及免疫佐劑作用奠定基礎(chǔ)。最后，分別用維氏氣單胞菌、純化的天然鞭毛蛋白和重組鞭毛蛋白FlaA刺激鯉魚，分別經(jīng)12h和4h后，提取頭腎總RNA。利用熒光定量PCR方法分析III鯉魚頭腎TLR5M及其信號(hào)通路中TRAF6、TNF-α
5、表達(dá)量的差異情況。熒光定量PCR結(jié)果表明，與細(xì)菌、天然鞭毛蛋白刺激組相比，重組鞭毛蛋白FlaA同樣能使頭腎中TLR5M、TRAF6、TNF-α的表達(dá)量升高，說明重組鞭毛蛋白FlaA能夠調(diào)節(jié)鯉魚TLR5M及其信號(hào)通路中的相關(guān)因子，進(jìn)而產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。關(guān)鍵詞：維氏氣單胞菌；鞭毛蛋白；TLR5M；調(diào)節(jié)IVAbstractRecombinantAeromonasveroniiFlagellinFlaAMediateToll-likeReceptor5MSignalingPathwayofCommoncarpCommoncarpisthedominant
6、speciesoffreshwateraquacultureinourcountryandoccupiesanimportantpositionintheaquacultureindustry.Withthegrowingscaleoffarmingandbreedingdensity,BacterialInfectionshasbecomeanobviousobstaclerestrictingthedevelopmentofaquaculture.Aeromonasveronii,aubiquitouspathogenintheaquatic
7、environment,cancausesepticemiaandulcerativesyndromeoffreshwaterfishesandcausehumandiarrheaorfoodpoisoningafterinfection.Thispathogenposesaseriousthreattofishfarmingandhumanhealth.Aeromonasveroniicanproduceavarietyofpathogenicvirulencefactors,suchaslipopolysaccharide,enterotox
8、in,outermembraneproteinandS-layerprotein,whichhaveindepthstudyabroad
