旋毛蟲nudix水解酶dna疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護

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1、學(xué)校代碼10459學(xué)號或申請?zhí)?01212262819密級公開邶糾kf碩士學(xué)位論文旋毛蟲Nudix水解酶DNA疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護作導(dǎo)學(xué)專培者師科業(yè)養(yǎng)姓姓門名院名：劉珮名：王中全教授類：醫(yī)學(xué)稱：病原生物學(xué)（寄生蟲學(xué))系：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院完成時間：2015年4月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEstablishmentofDNAvaccinewithNudixhydrolasefromTrichinellaspiralisanditsinducingimmuneresponseByPeiLiuS

2、upervisor:Prof.ZhongquanWangPathogenBiologyBasicMedicalCollegeApril2015學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行研宄所取得的成果。除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本聲明的法律責任由本人承擔。學(xué)位論文作者：如曰期：年1月、曰學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同

3、意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。學(xué)位論文作者：曰期?x?/上年上月>曰旋毛蟲Nudix水解酶DNA疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護碩士研究生劉珮導(dǎo)師王中全教授鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室（鄭州450052）河南省分子醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室（鄭州450052）摘要旋毛蟲病是一種幾

4、乎呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲病，主要因生食或半生食含旋毛蟲幼蟲的豬肉而感染。目前對旋毛蟲病尚無有效的預(yù)防疫苗和控制方法。因此，世界各國每年投入大量人力、物力及財力用于動物肉類中旋毛蟲的檢疫與獸用疫苗的研究，希望阻斷旋毛蟲病由動物向人類的傳播。近年來，感染性疾病的預(yù)防性DNA疫苗和腫瘤的治療性DNA疫苗的研究發(fā)展很快。DNA疫苗在接種后，其免疫和病毒的自然感染過程相似，促進黏膜免疫的發(fā)生，誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)，以及交叉保護反應(yīng)，外源的目的基因可以在體內(nèi)不斷表達蛋白，刺激免疫系統(tǒng)，所以DNA疫苗可誘發(fā)機體產(chǎn)生相對持久的免疫反應(yīng)。旋毛蟲對宿主小腸上皮細胞的附著、侵入是其致病的

5、關(guān)鍵，但其侵入機制目前尚不清楚。目前推測旋毛蟲對小腸上皮細胞的侵入可能是通過幼蟲的某些分泌性蛋白（即侵入相關(guān)因子）所介導(dǎo)的。本課題組前期通過旋毛蟲腸道感染性幼蟲與肌幼蟲的抑制消減雜交cDNA文庫，篩選出了一種分子量為46kDa且具有水解酶活性的旋毛蟲Nudix水解酶（TsNd），本論文采用減毒沙門氏菌介導(dǎo)TsNd基因進入小鼠體內(nèi)表達，重組質(zhì)粒通過真核表達載體進行攜帶，盡最大程度保證TsNd基因表達的蛋白與天然蛋白有相似性。以口服方式使TsNd重組沙門氏菌進入體內(nèi)，之后侵入腸道黏膜淋巴組織，目的基因就可以在抗原遞呈細胞中表達。TsNd重組菌免疫過程與旋毛蟲天然感染階段相似，含

6、整個腸道階段均同時以腸道為入侵起點。此外，本文還應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建TsNd基因的重組真核表達質(zhì)粒（即TsNdDNA肌肉注射疫苗），接種動物后觀察其在體內(nèi)的表達及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與免疫保護效果。I材料與方法1.旋毛蟲蟲種，載體，菌株，實驗動物及細胞系旋毛蟲（T1）由本教研室昆明小鼠傳代保種。pcDNA3.1+載體質(zhì)粒，大腸埃希菌（E.coli）JM109，由本實驗室凍存保存。雌性4周齡BALB/c小鼠購自河南省實驗動物中心。所用細胞系為乳倉鼠腎細胞BHK-21，來自河南省疾控中心細胞資源中心。鼠傷寒沙門氏菌⊿cyaSL1344株由河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院動物疫病與公共安全重

7、點實驗室惠贈。2TsNd的克隆及真核表達載體的構(gòu)建應(yīng)用生物信息學(xué)與ORFFinder在線預(yù)測工具分析TsNd基因的ORF，TsNd基因從第111位到1358位，總長1248bp，編碼415個氨基酸。設(shè)計并合成PCR引物，擴增出TsNd基因片段，將其插入到載體pcDNA3.1中構(gòu)成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TsNd,對其進行酶切以及測序鑒定正確后，將部分電轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌中，另一部分轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中保存。3重組沙門氏菌的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達在核酸水平，將TsNd基因電轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌液進行PCR鑒