旋毛蟲(chóng)nudix水解酶dna疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)

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1、學(xué)校代碼10459學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)?01212262819密級(jí)公開(kāi)邶糾kf碩士學(xué)位論文旋毛蟲(chóng)Nudix水解酶DNA疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作導(dǎo)學(xué)專培者師科業(yè)養(yǎng)姓姓門(mén)名院名：劉珮名：王中全教授類：醫(yī)學(xué)稱：病原生物學(xué)（寄生蟲(chóng)學(xué))系：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院完成時(shí)間：2015年4月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEstablishmentofDNAvaccinewithNudixhydrolasefromTrichinellaspiralisanditsinducingimmuneresponseByPeiLiuS

2、upervisor:Prof.ZhongquanWangPathogenBiologyBasicMedicalCollegeApril2015學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研宄所取得的成果。除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者：如曰期：年1月、曰學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬鄭州大學(xué)。根據(jù)鄭州大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同

3、意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)鄭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該學(xué)位論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為鄭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。學(xué)位論文作者：曰期?x?/上年上月>曰旋毛蟲(chóng)Nudix水解酶DNA疫苗構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)碩士研究生劉珮導(dǎo)師王中全教授鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室（鄭州450052）河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室（鄭州450052）摘要旋毛蟲(chóng)病是一種幾

4、乎呈全球性分布的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，主要因生食或半生食含旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的豬肉而感染。目前對(duì)旋毛蟲(chóng)病尚無(wú)有效的預(yù)防疫苗和控制方法。因此，世界各國(guó)每年投入大量人力、物力及財(cái)力用于動(dòng)物肉類中旋毛蟲(chóng)的檢疫與獸用疫苗的研究，希望阻斷旋毛蟲(chóng)病由動(dòng)物向人類的傳播。近年來(lái)，感染性疾病的預(yù)防性DNA疫苗和腫瘤的治療性DNA疫苗的研究發(fā)展很快。DNA疫苗在接種后，其免疫和病毒的自然感染過(guò)程相似，促進(jìn)黏膜免疫的發(fā)生，誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)，以及交叉保護(hù)反應(yīng)，外源的目的基因可以在體內(nèi)不斷表達(dá)蛋白，刺激免疫系統(tǒng)，所以DNA疫苗可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相對(duì)持久的免疫反應(yīng)。旋毛蟲(chóng)對(duì)宿主小腸上皮細(xì)胞的附著、侵入是其致病的

5、關(guān)鍵，但其侵入機(jī)制目前尚不清楚。目前推測(cè)旋毛蟲(chóng)對(duì)小腸上皮細(xì)胞的侵入可能是通過(guò)幼蟲(chóng)的某些分泌性蛋白（即侵入相關(guān)因子）所介導(dǎo)的。本課題組前期通過(guò)旋毛蟲(chóng)腸道感染性幼蟲(chóng)與肌幼蟲(chóng)的抑制消減雜交cDNA文庫(kù)，篩選出了一種分子量為46kDa且具有水解酶活性的旋毛蟲(chóng)Nudix水解酶（TsNd），本論文采用減毒沙門(mén)氏菌介導(dǎo)TsNd基因進(jìn)入小鼠體內(nèi)表達(dá)，重組質(zhì)粒通過(guò)真核表達(dá)載體進(jìn)行攜帶，盡最大程度保證TsNd基因表達(dá)的蛋白與天然蛋白有相似性。以口服方式使TsNd重組沙門(mén)氏菌進(jìn)入體內(nèi)，之后侵入腸道黏膜淋巴組織，目的基因就可以在抗原遞呈細(xì)胞中表達(dá)。TsNd重組菌免疫過(guò)程與旋毛蟲(chóng)天然感染階段相似，含

6、整個(gè)腸道階段均同時(shí)以腸道為入侵起點(diǎn)。此外，本文還應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建TsNd基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒（即TsNdDNA肌肉注射疫苗），接種動(dòng)物后觀察其在體內(nèi)的表達(dá)及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與免疫保護(hù)效果。I材料與方法1.旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種，載體，菌株，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系旋毛蟲(chóng)（T1）由本教研室昆明小鼠傳代保種。pcDNA3.1+載體質(zhì)粒，大腸埃希菌（E.coli）JM109，由本實(shí)驗(yàn)室凍存保存。雌性4周齡BALB/c小鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所用細(xì)胞系為乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21，來(lái)自河南省疾控中心細(xì)胞資源中心。鼠傷寒沙門(mén)氏菌⊿cyaSL1344株由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物疫病與公共安全重

7、點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。2TsNd的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)用生物信息學(xué)與ORFFinder在線預(yù)測(cè)工具分析TsNd基因的ORF，TsNd基因從第111位到1358位，總長(zhǎng)1248bp，編碼415個(gè)氨基酸。設(shè)計(jì)并合成PCR引物，擴(kuò)增出TsNd基因片段，將其插入到載體pcDNA3.1中構(gòu)成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TsNd,對(duì)其進(jìn)行酶切以及測(cè)序鑒定正確后，將部分電轉(zhuǎn)化入減毒沙門(mén)氏菌中，另一部分轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中保存。3重組沙門(mén)氏菌的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)在核酸水平，將TsNd基因電轉(zhuǎn)化后的沙門(mén)氏菌液進(jìn)行PCR鑒