弓形蟲多表位dna疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)作用

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1、弓形蟲多表位DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)作用【摘要】目的:構(gòu)建弓形蟲多表位DNA疫苗并研究其免疫保護(hù)效果。方法:將編碼含弓形蟲多個(gè)T、B細(xì)胞表位的6段弓形蟲多肽基因,以5個(gè)甘氨酸編碼基因相間隔相連接,克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(＋)中,構(gòu)建成多表位弓形蟲DNA疫苗。免疫BALB/c小鼠,測定其誘導(dǎo)的特異性抗體水平及T淋巴細(xì)胞增殖狀況,同時(shí)進(jìn)行弓形蟲攻擊感染保護(hù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:成功構(gòu)建了包含多個(gè)弓形蟲表位的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/TME,以其作為DNA疫苗免疫小鼠,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生弓形蟲特異性的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答,產(chǎn)生有效的抗弓形蟲保護(hù)性免

2、疫應(yīng)答。結(jié)論:構(gòu)建的弓形蟲多表位DNA疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答,在控制弓形蟲感染上具有可行性?！娟P(guān)鍵詞】弓形蟲表位DNA疫苗　　剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種人獸共患寄生蟲病,廣泛流行于我國及世界各地,全球感染率高達(dá)25%～35%,我國人群感染率為5%～20%。成人感染弓形蟲后多呈無癥狀帶蟲者,孕婦感染后可造成流產(chǎn)、胎兒畸形以及胎兒死亡等不良妊娠結(jié)局,免疫功能受抑制或有免疫缺陷的患者合并弓形蟲感染時(shí),可成為患者死亡的主要原因之一［1,2］。近年來,國內(nèi)外學(xué)者在弓形蟲疫苗

3、的研究上進(jìn)行了大量的探索工作,11大致經(jīng)歷了全蟲疫苗、蟲體特異組分疫苗和核酸疫苗等階段,但均尚未研制出安全有效疫苗。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),弓形蟲全蟲疫苗、特異抗原組分疫苗有預(yù)防弓形蟲感染或降低感染程度作用,但前者可能會引起再感染,后者的免疫保護(hù)效果較差［3-5］。弓形蟲病核酸疫苗有望彌補(bǔ)上述疫苗存在的不足,具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景,但目前研究尚處于初始階段,而且對弓形蟲多表位DNA疫苗的研究尚缺乏報(bào)道。本研究中我們將編碼含弓形蟲多個(gè)T、B細(xì)胞表位的6段弓形蟲多肽基因（分別編碼SGA1238～256aa、SGA1281～320aa、GRA1170～193aa、

4、GRA4331～345aa、GRA4229～245aa和GRA2171～185aa）,以5個(gè)甘氨酸編碼基因相間隔進(jìn)行連接,克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1中,構(gòu)建成多表位弓形蟲DNA疫苗,以期獲得更好的免疫保護(hù)效果,為構(gòu)建安全有效的多表位弓形蟲DNA疫苗提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)?！　?材料和方法　　1.1材料質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、大腸桿菌DH5α及弓形蟲RH國際標(biāo)準(zhǔn)株均為本室保存。核酸內(nèi)切酶EcoRI、BamHI,T4連接酶購自美國MBI公司。胎牛血清購自天津正江生物公司。兔抗小鼠IgGHRP購自博士德公司。TMB為美國Sigma公司產(chǎn)品。RP

5、MI1640為美國Gibico公司產(chǎn)品。MTT（四甲基偶氮唑鹽）為美國Amresco公司產(chǎn)品。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自丹麥Costor公司。BALB/c及ICR小鼠購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。11　　1.2方法　　1.2.1真核表達(dá)載體pcDNA3.1/TME的構(gòu)建目的基因片段,包含編碼弓形蟲SGA1238～256aa、SGA1281～320aa、GRA1170～193aa、GRA4331～345aa、GRA4229～245aa和GRA2171～185aa6個(gè)多肽片段的基因（GenBankS76248,M26007,M76432,L01753）,每

6、片段間以5個(gè)甘氨酸編碼基因相間隔進(jìn)行連接,并在5'端添加了BamHI酶切位點(diǎn)和ATG啟動密碼子,3′端添加了TAA終止密碼子和EcoRI酶切位點(diǎn),共483bp,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。按常規(guī)方法將該目的基因插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序鑒定無誤后,命名為pcDNA3.1/TME?！　?.2.2質(zhì)粒的大劑量提取及純化堿裂解法分別大劑量提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1/TME和空質(zhì)粒pcDNA3.1,并用聚乙二醇沉淀法純化后,經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量,溶于滅菌

7、去離子水中,濃度均為1g/L?！　?.2.3動物免疫SPF級雌性6周齡BALB/c小鼠32只,隨機(jī)分為兩組,即注射pcDNA3.1空質(zhì)粒的對照組和注射重組質(zhì)粒pcDNA3.1/TME的實(shí)驗(yàn)組,每組16只。每只小鼠均先用2.5mL/L鹽酸布比卡因50μL分別注射小鼠雙側(cè)脛前肌進(jìn)行預(yù)處理,311d后在小鼠雙側(cè)脛前肌相同部位各注射50μL（50μg）質(zhì)粒,每只小鼠每次免疫的質(zhì)?？偭繛?00μg。3周后以相同方法和劑量加強(qiáng)免疫1次。　　1.2.4弓形蟲速殖子培養(yǎng)裂解物（TLA）的制備液氮凍存的弓形蟲RH強(qiáng)毒株凍存管投入37℃水浴中復(fù)蘇后,抽取0.1mL腹

8、腔注射ICR小鼠,待小鼠出現(xiàn)發(fā)病癥狀（如豎毛、不食、肛門拖糞、呼吸困難等）后,用3mL生理鹽水沖洗小鼠腹腔,抽取的腹腔液腹