ct momp168多表位蛋白疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)作用的分析

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1、優(yōu)秀畢業(yè)論文lII]11IIIIIIFFIIIIIIIII＼1946024目中文摘要1●英文摘要．4l英文縮寫詞．．8前言9第一部分材料與方法11結(jié)果．16分析與討論．18第二部分材料與方法20結(jié)果24分析與討論27一第三部分●0材料與方法29結(jié)果．38分析與討論45第四部分材料與方法47結(jié)果49分析與討論．．53，J、結(jié)55參考文獻(xiàn)．．56附錄．62致謝．．63綜述及參考文獻(xiàn)64精品參考文獻(xiàn)資料優(yōu)秀畢業(yè)論文溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文DMOMPl68多表位疫苗的免疫原性及其免疫保護(hù)作用的研究‘中文摘要目的：【1】培養(yǎng)、鑒定和純化E血清型沙眼衣原體(C

2、hlamydiatrachomatis，c0【2】建立小鼠生殖道E血清cf感染模型【3】制備沙眼衣原體主要外膜蛋白(majoroutermembraneprotein,MOMP)MOMPl68多表位，研究MOMPl68多表位的免疫原性，包括體液免疫和細(xì)胞免疫；【4】研究MOMPl68多表位的對小鼠生殖道E血清Cf感染的免疫保護(hù)作用。方法：【1】將pET32㈣／CtMOMPl68重組質(zhì)粒及pET32a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌株，通過IPTG誘導(dǎo)，并經(jīng)Ni．NTA樹脂親和層析法純化，制備CtMOMPl68多表位和載體蛋t芻(Trx-his)，用于免疫原性

3、和免疫保護(hù)作用研究；【2】采用Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)E血清型沙眼衣原體(C黟并采用方法PCR，Giemsa、Lugol，S碘染和間接免疫熒光進(jìn)行D包涵體的鑒定以及采用反復(fù)凍融和超速辦離心的方法進(jìn)行。純化；3【3】小鼠生殖道E血清型。感染模型的建立：以106包涵體形成單位(Inclusionformingunits，wu)劑量的。原體(Elementarybody,EB)感染BALB／c小鼠生殖道，同時D保存液(SPG)作為陰性對照。小鼠感染。后，通過外生殖道炎癥觀察、陰道分泌物CtPCR鑒定、病理切片等分析小鼠模型是否構(gòu)建成功；【4】選擇乒8周BAL

4、B／e雌性小鼠，每組9只，用MOMPl68多表位重組蛋白免疫。同時設(shè)置PBS、載體蛋白(Trx．his)、滅活沙眼衣原體對照組。采用0、2、4W皮下多點注射免疫，共免疫3次；隔周采集陰道分泌液和斷尾取血分離血清，分別進(jìn)行分泌液IgA和血清培G、IgA、IgM、埯GI、IgG2a、192b、IgG3的檢測，并在末次免疫后取小鼠脾淋巴細(xì)胞檢測其CTL(CytotoxcityTlymphocytes，CTL)的殺傷活性和Elisa檢測血清中細(xì)胞因子IFN．，t和Ⅱ，4的含量；【5】于末次免疫后第2周用106IFU的E血清型Q進(jìn)行小鼠生殖道感染攻擊。通過

5、下列方法分析其免疫保護(hù)作用。1．通過觀察小鼠生殖道炎癥觀察和評分一●叩；一’并觀察炎癥的持續(xù)時間；2．通過ELISA檢測小鼠生殖道特異性IgA抗體水平，及經(jīng)斷尾取血分離血清檢測特異性IgG抗體水平；3．Ct攻擊前后抗體水平比較，血清IgG抗體和陰道分泌物IgA；4．隔周采集陰道分泌物進(jìn)行。分離和精品參考文獻(xiàn)資料優(yōu)秀畢業(yè)論文溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文鑒定、并計數(shù)，以分析各組小鼠生殖道cf清除率等；5．Ct攻擊后4周，取小鼠生殖器官進(jìn)行大體和病理切片觀察，以分析cf攻擊產(chǎn)生的炎癥情況。分析MOMPl68多表位重組蛋白對小鼠生殖道感染E血清型。攻擊的免疫保

6、護(hù)作用。結(jié)果：^?rj．【1】通過原核表達(dá)系統(tǒng)，分別獲得純化MOMPl68多表位和載體蛋I芻(Trx．his)，蛋白表達(dá)量高達(dá)0．9mg／ml、0．6mg／ml?！?】E血清型Ct經(jīng)感染Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)72h,培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)Lugos碘液染色法，Giemsa染色法、間接免疫熒光等方法進(jìn)行。包涵體鑒定，同時進(jìn)行PCR檢測。的DNA，結(jié)果證實。培養(yǎng)成功。并經(jīng)反復(fù)凍融和超速離心的方法獲得了純化的E血清型@其刪值為lxl08IFU／ml。為建立生殖道感染模型和檢測。奠定了實驗基礎(chǔ)?！?】MOMPl68多表位免疫BALB／e小鼠后，采用ELISA方法檢測生殖

7、道分泌物及其血清中特異性抗體水平及其動態(tài)變化；采用LDH方法檢測CTL的特異性殺傷及ELISA方法其血清內(nèi)細(xì)胞因子水平。體液免疫：ELISA結(jié)果顯示MOMPl68多表位免疫組能刺激機體產(chǎn)生較高抗滅活C瞼菌體的特異性血清IgG和生殖道粘膜Igg抗體水平。隨著免疫次數(shù)焉的增加，抗體水平持續(xù)上升；血清抗體的類型以IgGl為主；在末次免疫后檢澳EJlgG抗體水平，MOMPl68多表位組分別與載體組(Trx．his)、PBS組相比有均≯顯著差異性(Tl=12．587，p

8、OMPl68多表位免疫組與載體組、PBS組相比較：(T1=13．664,Wc0．001；T1=5．996，p=O．004)。滅活的。組I