研制具有較高免疫保護作用的DNA疫苗

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1、研制具有較高免疫保護作用的SjserpinDNA疫苗立項依據(jù)目前我國仍有108個縣有血吸蟲病流行，69.5萬人感染血吸蟲病，并且隨著近年來長江洪水泛濫和退耕還湖又有重新升高的趨勢[1]。多年來，控制血吸蟲病以化療為主．輔以易感地帶滅螺的綜合性防治措施，取得較好的效果。但由于在流行區(qū)化療停止后再感染迅速出現(xiàn)和長期、反復(fù)、大規(guī)模使用吡喹酮化療，血吸蟲對吡喹酮的潛在耐藥性，迫切需要發(fā)展血吸蟲疫苗以補充血吸蟲病的防治措施[2]。DNA疫苗作為一種新型的疫苗，已在包括寄生蟲感染在內(nèi)的多個領(lǐng)域內(nèi)開展了廣泛研究[3]．但是現(xiàn)行的酶抗原，血吸蟲肌球蛋白組抗原，血吸蟲膜相關(guān)蛋白，

2、血吸蟲鈣相關(guān)蛋白，血吸蟲線粒體相關(guān)蛋白和信號蛋白，血吸蟲性別相關(guān)蛋白等制作出的DNA疫苗的免疫保護效果僅有小幅增加[4]。最新研究表明，來自哺乳動物內(nèi)部的消化酶：胰蛋白酶和胰彈性蛋白酶(PE)很容易被抑制[5],以纖溶酶原激活物抑制因子2為代表了一種細胞抑制劑（serpin）可以通過一種獨立的途徑（不經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體）分泌到細胞外[6]。據(jù)文獻[7]報道多房棘球絳蟲六鉤蚴入侵人體階段，分泌的serpin，能夠阻斷宿主消化酶的酶解攻擊，這樣，Sjserpin就可以在免疫系統(tǒng)做為一個靶位，引發(fā)免疫反應(yīng)[8]。因此，本實驗將能夠表達serpin的血吸蟲的一段cDN

3、A進行PCR擴增，制作出SjserpinDNA疫苗，并對小鼠保護性免疫進行檢測，進而為人類血吸蟲防治提供新思路。實驗摘要提取全長的日本血吸蟲中國大陸株絲氨酸蛋白酶抑制劑(Sjserpin)基因，并將其克隆到真核表達載體pcDNA3.1，構(gòu)建DNA疫苗pcDNA3.1—serpin；制備SjserpinDNA疫苗和對照pcDNA3.1。將20只BALB/c小鼠隨機分為A、B2組。A組小鼠肌注100ugpcDNA3.1；B組注射100ugpcDNA3.l-Sjserpin。每隔2周各免疫1次，共3次。第8周每鼠感染30±2條／只尾蚴，45d后剖殺，計數(shù)成蟲及肝內(nèi)蟲卵

4、。采用免疫組化法檢測局部組織中Sjserpin的表達；用脾細胞培養(yǎng)法檢測經(jīng)Sjserpin刺激后．攻擊前、后小鼠脾細胞IL-2,IL-4,IL-10和IFN-r的水平。用ELISA檢測血清中抗Sjserpin抗體。實驗內(nèi)容動物保護性實驗2DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制備1研究SjserpinDNA疫苗作用機制3數(shù)據(jù)處理4實驗方法步驟1.11.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)Sjserpin的基因序列設(shè)計兩條引物P1和P2，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，分別在Pl和P2的5'端引入BamHI和Xhol的酶切位點。以日本血吸蟲童蟲cDNA文庫為模版

5、進行PCR擴增。1.DNA疫苗pcDNA3.1-Sjserpin的制備Sjserpin亞克隆入pcDNA3.11.2將PCR產(chǎn)物與T載體pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，培養(yǎng)提取Sjserpin，并以此為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物Sjserpin再與pcDNA3.1連接，用同樣方法得到重組質(zhì)粒[9]。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，作DNA測序進一步確認(rèn)。1.3DNA疫苗pcDNA3.1，pcDNA3.1-Sjserpin的制備按說明書用大規(guī)模質(zhì)粒純化試劑盒Qiagen2500大量制備，制得的質(zhì)粒。DNA溶解于無菌的生理鹽水(0.9％)中．在核酸蛋白測定儀上測定OD值，計

6、算DNA濃度。2.動物保護性實驗將20只小鼠隨機分為A，B2組，每組10只。A組(pcDNA3.1組)經(jīng)小鼠股四頭肌注射100ugpcDNA3.1質(zhì)粒DNA；B組(Sjserpin組)注射100ugpcDNA3.l-sjserpin質(zhì)粒DNA。分別于第0、2、4周各免疫接種一次（劑量和方法相同)．于第8周每鼠以30+/-2條／只尾蚴用腹部貼片法攻擊感染，攻擊后45d剖殺小鼠收集成蟲計數(shù)，取出肝臟稱重后用5％KOH37℃消化過夜，進行蟲卵計數(shù)。按公式：減蟲率=(對照組平均每鼠成蟲數(shù)-實驗組平均每鼠成蟲數(shù))／對照組平均每鼠成蟲數(shù)×100％．減卵率=(對照組平均每鼠蟲

7、卵數(shù)一實驗組平均每鼠蟲卵數(shù))/對照組平均每鼠蟲卵數(shù)×100％．計算減蟲率及減卵率。3.13.研究SjserpinDNA疫苗作用機制Sjserpin在小鼠局部肌肉組織內(nèi)的表達每組各取2只小鼠在第一次免疫后10d再以同劑量加強免疫一次，4d后剖殺小鼠，取兩腿股四頭肌做冰凍切片，Sjserpin的組化檢測首先在每張冰凍切片上加入日本血吸蟲重感染兔血清．4℃過夜后加二抗羊抗兔IgG-HRP，反應(yīng)后經(jīng)DAB顯色，顯微鏡下觀測結(jié)果。3.2細胞因子檢測訪談結(jié)果與析雙抗體夾心法分別于攻擊前后2周每組各取兩只小鼠拉頸處死，取出脾臟，常規(guī)法制備單個脾細胞懸液，用10％FCSRPMI

8、1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細