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《胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定作者：徐漢榮，晉光榮,張海軍，趙連東,顧寶榮［摘要］目的：探討從胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞(neuralstemcell,NSCs)的方法及NSCS的特性。方法：將145d胎齡的大鼠額葉皮質(zhì)腦組織制備成單細胞懸液，于含EGF和bFGF的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，形成原代細胞球后，進行單細胞克隆傳代擴增。免疫熒光組化方法檢測克隆球Nestin、Map2、GFAP抗體標記情況。結(jié)果:原代培養(yǎng)2周后，可形成大量懸浮生長的神經(jīng)球，BrdU和Nestin檢測呈陽性，誘導(dǎo)分化后呈Map2、GFAP陽性。結(jié)論:可
2、從胚鼠腦皮質(zhì)中分離培養(yǎng)純化、擴增傳代獲得NSCs,經(jīng)誘導(dǎo)后可以分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，可作為細胞替代治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的供體來源。［關(guān)鍵詞］神經(jīng)干細胞;純化;誘導(dǎo)分化；大鼠神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、缺血及退行性疾病的治療一直是困擾醫(yī)學(xué)界的一個難題。人和哺乳動物體內(nèi)及胚胎體內(nèi)神經(jīng)干細胞(neuralstemcells,NSCs)的發(fā)現(xiàn)，為解決這一難題點燃了新的希望。目前，眾多學(xué)者從各種途徑探索治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物材料及治療方法［12］。NSCs是一類具有自我更新和多向分化潛能的特殊細胞。利用它不僅可以探討神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機制，也可作為細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、退行性
3、疾病及腦腫瘤等疾病。胚胎期的NSCs主要位于紋狀體、大腦皮質(zhì)、視網(wǎng)膜以及脊髓等部位［1,3］,目前利用細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成功地從上述部位分離出多潛能NSCso盡管NSCs是未分化細胞，不同來源的NSCs之間仍有差別。與中腦及脊髓起源的NSCs相比，紋狀體及皮質(zhì)NSCs更適合于細胞移植替代那些因腦內(nèi)疾病受損的神經(jīng)元［4］。本研究以胚胎大鼠為供體，采用單細胞克隆技術(shù)選擇性分離探索了大腦額葉皮質(zhì)NSCs的純化、標記、不同誘導(dǎo)分化方法及鑒定技術(shù)，為進一步研究NSCs的生物學(xué)特性和NSCs移植替代治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供生物材料及方法。1材料與方法11材料145d胎齡的SD大鼠由東
4、南大學(xué)動物實驗中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品，B27輔助培養(yǎng)基、堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)及表皮細胞生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)均為Gibco公司產(chǎn)品，兔抗大鼠Map2和兔抗大鼠GFAP抗體購自美國R&；D公司，其他免疫組化試劑購自北京中山公司。1.2方法121取材與培養(yǎng)無菌條件下脫頸處死大鼠，在體視顯微鏡下小心解剖大腦額葉皮質(zhì)，機械剪碎,015%胰蛋白酶消化lOmin,含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化5mino滴管反復(fù)吹打成單
5、細胞懸液,1000r・；min-l離心lOmino細胞重懸于NSCs培養(yǎng)液，即DMEM/F12（1：1）,B27（體積分數(shù)為0.02）,EGF（20ng・；ml-l）,FGF（20ng・；ml-l）□調(diào)整細胞濃度為（4—5）X105ml-lo接種到塑料培養(yǎng)瓶，置于371、5%C02培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，每3~4d更換培養(yǎng)液1次。待原代克隆形成后再次用機械分離法制作單細胞懸液，按5X105細胞密度接種于50ml培養(yǎng)瓶中，每隔7?10d機械分離克隆傳代1次，用1ml注射器（帶5號針頭）用力吹打混勻（同時換培養(yǎng)液）。采用有限稀釋法單細胞克隆
6、連續(xù)傳代。將細胞接種于96孔板，選取只有1個細胞的孔連續(xù)觀察，將其增殖所形成的單細胞克隆機械分離成單細胞懸液，將所有細胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中,待次代克隆長成后連續(xù)傳代。122NSCs增殖與分化的標記鑒定克隆球Nestin鑒定:將經(jīng)過多次連續(xù)傳代所形成的克隆細胞球接種于預(yù)先置有多聚賴氨酸涂層蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)液成分為DMEM/F12（1：1）、B27輔助培養(yǎng)基（1X50）、20ng・；ml-lbFGF和20ng・；ml-lEGF,培養(yǎng)7d后行免疫熒光細胞化學(xué)染色，觀察NSCs特異性抗原Nestin的表達情況。克隆球誘導(dǎo)分化細胞的鑒定：將經(jīng)
7、過多次連續(xù)傳代所形成的克隆細胞球吹打成單細胞，調(diào)整細胞濃度為（4?5）X105ml-1接種到含5mmol・；L-l無血清DMEM/F12（含20ng・；ml-lbFGF,20ng・；ml-1EGF及B27輔助培養(yǎng)液）塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)形成新的神經(jīng)球。將神經(jīng)球接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔板，加入20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液貼壁生長。7d后4%多聚甲醛固定分化細胞5min,封閉液（1%山羊血清蛋白,03%TritonlOO）封閉30mino加一抗過夜,PBS漂洗3次，每次lOmin,然后加入FITC熒光素或羅丹明的相應(yīng)二抗，孵
