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《酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆姓名:馬麗蘋申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):微生物學(xué)指導(dǎo)教師:彭遠(yuǎn)義2003.5.1西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生論文摘要植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇和無機(jī)磷酸鹽的一類酶,它能夠解除動物植物性飼料中植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用,提高植物性飼料的營養(yǎng)價(jià)值,因而受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注,尤其是微生物所產(chǎn)生的酸性植酸酶。但微生物野生菌株產(chǎn)酶水平較低,制約了微生物植酸酶在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用,因此提高植酸酶野生菌株的產(chǎn)酶水平是實(shí)現(xiàn)其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。目前,提高野生菌株產(chǎn)酶水平的主要思路是通過基因
2、工程手段克、隆其植酸酶基因,然后在生物反應(yīng)器中高效表達(dá)該植酸酶基因。才g實(shí)驗(yàn)的目的旨在從K土壤中篩選出酸性植酸酶高產(chǎn)菌株,并克隆其植酸酶基因,從而為植酸酶的基因工程提供基因材料。;主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.用植酸鈣選擇性平板培養(yǎng)基從土樣中篩選出了102株能產(chǎn)透明圈的菌株,經(jīng)分離純化后,接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基,28℃、220r/min發(fā)酵5天,在37℃、pH2.5條件下用釩鉬酸銨法測定其所產(chǎn)植酸酶的活力,結(jié)果顯示,酶活較高的有24株,經(jīng)再次搖瓶復(fù)篩后,酶活大于15U/ml且產(chǎn)酶性能穩(wěn)定的共有7株,其中以‘l礦菌株的酶活最高,
3、可達(dá)53.86U/ml,經(jīng)初步鑒定為黑曲霉,編號為Aspergillus.nigerl。2.用氯化芐法提取了Aspergillus.nigerl44基因組DNA,根據(jù)GeneBank中已知的黑曲霉植酸酶基因序列設(shè)計(jì)出一對特異性引物(上游引物:57ATAGGCATCATGGGCGTCTC37下游引物:57CAGCTAAGCAAAACACTCCGC37),采用Pyrobest?DNApolymerase(高保真DNA聚合酶),通過PCR方法從Aspergillus.nigerl4“基因組DNA中擴(kuò)增出了預(yù)期的1.5kb
4、左右的特異性產(chǎn)物,將其與pMDl8一TVector連接后,轉(zhuǎn)化E.colff3H5a菌株的感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)質(zhì)粒抽提、酶切鑒定,確認(rèn)該目的產(chǎn)物已得到成功克隆。3.核苷酸序列分析表明,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中包含有完整的phyA基因,該基因全長1506bp,其中包含一段長102bp的內(nèi)含子,該內(nèi)含子具有真菌植酸酶基因內(nèi)含子的特征保守序列:Donor序列—-Gn盯Gc,Lariat序YO--GCTGAC及Acceptor序列一CAG。該基因編碼467個氨基酸,理論分子量為5l37kDa,其上有13個潛在的N一糖基化位點(diǎn),N端19個
5、氨基酸為信號肽序列,植酸騎活性位點(diǎn)序列(CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK)位于氨基酸序列的+71~+93。4.序列比較結(jié)果顯示,本研究克隆的phyA基因與A.nigerNRRL3135、Aniger5K。57和A.nigerN25的phyA基因的同源性分別是96%、96%和92%,編碼的氨基酸序列同源性分別為98.10%、95.70%和97.90%。k~,一關(guān)鍵詞:酌啦植酸酶菌株篩選基因克隆。____一—。一’’。-m_,l酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆Thescreeningofanacidic
6、phytase—producingstrainandthecloningofitsphytasegeneMaLiping(CollegeofAnimalandVeterinaryScience,SouthwestAgricultureUniversityChongqing4007l6jAbstractPhytaseisakindofenzymeswhichcarlcatalyzethehydrolysisofphytateintomyo—inositolandphosphate.ItCallrelieveanti—
7、nutritionofphytateandimprovethenutritionalvalueofanimalfeedfromplant,thestudyonphytase,especiallyacidicphraseproducedbymicro—organism,ispaidmuchattentionbyscientistsinourcountryandabroard.However.itswideapplicationsinmanufacturearerestrictedbysuchaquestionaslo
8、wphytase—producinglevelofwildstrains,sobeforethewildstrainswhichcanproduceacidicphytasearewidelyused,theirphytaseactivitiesmustbeimprovedbyvariousmeansinwhichusinganefficientexpres