酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆

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1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆姓名：馬麗蘋申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：彭遠(yuǎn)義2003.5.1西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生論文摘要植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇和無機(jī)磷酸鹽的一類酶，它能夠解除動物植物性飼料中植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高植物性飼料的營養(yǎng)價(jià)值，因而受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注，尤其是微生物所產(chǎn)生的酸性植酸酶。但微生物野生菌株產(chǎn)酶水平較低，制約了微生物植酸酶在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，因此提高植酸酶野生菌株的產(chǎn)酶水平是實(shí)現(xiàn)其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在。目前，提高野生菌株產(chǎn)酶水平的主要思路是通過基因

2、工程手段克、隆其植酸酶基因，然后在生物反應(yīng)器中高效表達(dá)該植酸酶基因。才g實(shí)驗(yàn)的目的旨在從K土壤中篩選出酸性植酸酶高產(chǎn)菌株，并克隆其植酸酶基因，從而為植酸酶的基因工程提供基因材料。；主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1．用植酸鈣選擇性平板培養(yǎng)基從土樣中篩選出了102株能產(chǎn)透明圈的菌株，經(jīng)分離純化后，接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、220r／min發(fā)酵5天，在37℃、pH2．5條件下用釩鉬酸銨法測定其所產(chǎn)植酸酶的活力，結(jié)果顯示，酶活較高的有24株，經(jīng)再次搖瓶復(fù)篩后，酶活大于15U／ml且產(chǎn)酶性能穩(wěn)定的共有7株，其中以‘l礦菌株的酶活最高，

3、可達(dá)53．86U／ml，經(jīng)初步鑒定為黑曲霉，編號為Aspergillus．nigerl。2．用氯化芐法提取了Aspergillus．nigerl44基因組DNA，根據(jù)GeneBank中已知的黑曲霉植酸酶基因序列設(shè)計(jì)出一對特異性引物(上游引物：57ATAGGCATCATGGGCGTCTC37下游引物：57CAGCTAAGCAAAACACTCCGC37)，采用Pyrobest?DNApolymerase(高保真DNA聚合酶)，通過PCR方法從Aspergillus．nigerl4“基因組DNA中擴(kuò)增出了預(yù)期的1．5kb

4、左右的特異性產(chǎn)物，將其與pMDl8一TVector連接后，轉(zhuǎn)化E．colff3H5a菌株的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)粒抽提、酶切鑒定，確認(rèn)該目的產(chǎn)物已得到成功克隆。3．核苷酸序列分析表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中包含有完整的phyA基因，該基因全長1506bp，其中包含一段長102bp的內(nèi)含子，該內(nèi)含子具有真菌植酸酶基因內(nèi)含子的特征保守序列：Donor序列—-Gn盯Gc，Lariat序YO--GCTGAC及Acceptor序列一CAG。該基因編碼467個氨基酸，理論分子量為5l37kDa，其上有13個潛在的N一糖基化位點(diǎn)，N端19個

5、氨基酸為信號肽序列，植酸騎活性位點(diǎn)序列(CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK)位于氨基酸序列的+71~+93。4．序列比較結(jié)果顯示，本研究克隆的phyA基因與A．nigerNRRL3135、Aniger5K。57和A．nigerN25的phyA基因的同源性分別是96％、96％和92％，編碼的氨基酸序列同源性分別為98．10％、95．70％和97．90％。k～，一關(guān)鍵詞：酌啦植酸酶菌株篩選基因克隆。____一—。一’’。-m_，l酸性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選及其基因克隆Thescreeningofanacidic

6、phytase—producingstrainandthecloningofitsphytasegeneMaLiping(CollegeofAnimalandVeterinaryScience，SouthwestAgricultureUniversityChongqing4007l6jAbstractPhytaseisakindofenzymeswhichcarlcatalyzethehydrolysisofphytateintomyo—inositolandphosphate．ItCallrelieveanti—

7、nutritionofphytateandimprovethenutritionalvalueofanimalfeedfromplant，thestudyonphytase，especiallyacidicphraseproducedbymicro—organism，ispaidmuchattentionbyscientistsinourcountryandabroard．However．itswideapplicationsinmanufacturearerestrictedbysuchaquestionaslo

8、wphytase—producinglevelofwildstrains，sobeforethewildstrainswhichcanproduceacidicphytasearewidelyused，theirphytaseactivitiesmustbeimprovedbyvariousmeansinwhichusinganefficientexpres