資源描述：
《奉節(jié)臍橙果皮褐變生理及相關基因的分離研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、中文摘要摘要奉節(jié)臍橙(CitrussinensisOsbeek)是一種優(yōu)良的甜橙鮮食品種，在國內外市場享有較高聲譽，是重慶市柑橘出口中唯一具有較強競爭優(yōu)勢的品種。但奉節(jié)臍橙果皮褐變發(fā)生較嚴重，主要癥狀為油胞破裂下陷、形成褐斑，極大地影響了果實的外觀質量和商品價值。目前對臍橙果皮褐變的發(fā)生機制尚未進行深入研究，缺乏相應的控制措施，這己成為目前臍橙商品生產發(fā)展的關鍵制約因素。因此迫切需要開展果皮褐變的生理及分子機制研究。本研究以‘奉園72．1’臍橙為材料，果實采后分別采用常溫(15"0)貯藏(對照)、低溫(5℃)貯藏、打蠟或機械損傷后
2、常溫保藏。貯藏lO周，每周測定一次生理指標。果皮褐變率統(tǒng)計結果顯示，打蠟和機械損傷能加速果皮褐變的發(fā)生，5"12低溫貯藏可以減少果皮褐變。對過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性研究發(fā)現，果皮褐變最嚴重的損傷果POD和PPO活性較高；打蠟促進PPO活性上升，而低溫能有效抑制PPO活性．對苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性研究發(fā)現，PAL活性與果皮褐變率之間高度相關，損傷處理PAL活性最高。通過半定量RT-PCR方法研究pal基因在機械損傷和果皮褐變過程中的作用，發(fā)現損傷能增強pal2基因表達，且褐變果中pal2的表達明顯強于未褐
3、變果；pal6基因的表達模式與pal2相似，即在損傷果和褐變果中均表達增加，但pal6基因的表達水平明顯低于pn乜。因此我們認為隊L活性及pal基因表達與臍橙果皮褐變之間具有密切關系，在果實受到損傷和果皮褐變過程中，pal2基因對PAL酶活性的影響強于pal6基因．在第二次生理落果結束后進行葉面噴鈣結合單果套袋處理可顯著降低果實采后果皮褐變的發(fā)生，提高果實外觀質量和商品性。綜合以上研究結果發(fā)現：田間噴鈣、套袋處理后適期采收，在采后處理及貯運中盡量減少機械損傷，采用適宜低溫冷藏可有效減輕臍橙果皮褐變的發(fā)生。為了探明臍橙果皮褐變的分子
4、機制，分別以褐變與未褐變的果皮mRNA作為檢測方和驅動方，利用抑制差減雜交(sSH)技術，構建了臍橙果皮褐變正向差減eDNA文庫。SSH文庫中陽性克隆92個，陽性克隆比例為70％，重組子插入片段大小主要分布在150bp．600bp之問．隨機挑取部分陽性克隆測序，測序結果利用NCBI的BLASTn和BLASTx在線軟件進行序列相似性分析。在50個已經浸9序的克隆中單一克隆為28個，其中有22個在GenBank中具有同源序列，占單一克隆數的78．6％，另有6個未找到同源序列，可能代表了新基因。同源基因中包含了與物質代謝、成熟衰老以及脅
5、迫病害相關的蛋白質，說明柑橘果皮褐變的發(fā)生是一重慶人學博士學位淪文個涉及到衰老、脅迫反應、信號轉導等多方面的復雜的生理生化過程。以柑橘管家基因ubiquitin為內對照，通過半定量RT-PCR方法鑒定差減文庫中分離的鈣結合蛋白基因、半胱氨酸蛋白酶基因、NAC-：I或蛋白基因、脅迫與病害相關蛋白基因和膨脹素基因是否為果皮褐變差異表達基因，結果顯示它們均在褐變果皮中有上調表達，說明這些基因表達的增強可能與果皮褐變密切相關。為了進一步獲得果皮褐變相關基因的信息，采用RACE技術克隆了3個果皮褐變差異基因的全長eDNA序列：(1)臍橙膨脹
6、素基因CsEXP(GenBank登錄號DQ665898)，全長1077bp，編碼252個氨基酸，分子量為26．86kDa，等電點為7．93。同源性分析顯示CsEXP與膨脹素(Expansin)具有很高的同源性，具有ct-Expansin蛋白的保守序列，即c．端的缸y殘基，序列中央的HFDmotif以及N一端的eys殘基；生物信息學分析表明其N．端具有一信號肽序列，跨膜預測結果表明該蛋白的N端4．23aa處有一跨膜結構．(2)臍橙脅迫與病害相關蛋白基因CsSPR(登錄號EF010853)，全長679bp，編碼161個氮基酸，分子量為
7、17．60KDa，等電點為5．74。沒有信號肽序列和跨膜區(qū)。具有病害相關蛋白的保守結構域BetV1．(3)臍橙鈣結合蛋白基因CsCAB(登錄號EF010854)，全長984bp，編碼207個氨基酸，分子量為22．95KDa，等電點為4．5，沒有信號肽序列和跨膜區(qū)。具有鈣結合蛋白的保守的兩個EF-hand結構域。以CsEXP、CsSPR、CsCAB基因的3’．非同源區(qū)標記同位素32P為探針，分別與褐變、非褐變果皮RNA進行Northern雜交；另外，以CsEXP3"-非同源區(qū)為探針，與400、400C、傷害、0％02、3％02和乙烯
8、處理后6h，12h，24h的果皮RNA進行Northern雜交，結果顯示，DE扭，CsSPR，CsCAB在褐變果皮中的表達均明顯高于對照，進一步證實它們屬于果皮褐變相關基因；CsEXP在脅迫初期的表達分析顯示，高溫(400c)抑锘IjCsEXP的表
