農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿耐鹽SOS多基因遺傳轉(zhuǎn)化研究

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1、分類號(hào)：Ｓ３３２單位代碼：１０７４９密級(jí)１２０１３１４００３０：公開(kāi)學(xué)號(hào)：寧夏大學(xué)博士學(xué)位論文農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜宿耐鹽多基因遺傳轉(zhuǎn)化研究Ａｒｏｂａｃｔｅｒｕｍｍｅａｃｅｎｓ－ｍｅｄａｅｄａｎｓｆｏｒｍａｈｇｉｔｕ／ｉｉｔＴｒｔｉｏｎｗｉｔ－ｏｅｒａｎＳａｌｔｔｌｔＳＯＳｅｎｅｓｉｎＡｌｆａｌｆａｇ學(xué)位申請(qǐng)人：王靜指導(dǎo)教?zhēng)煟涸S興教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別：農(nóng)學(xué)博士專業(yè)名稱：草學(xué)研究方向：牧草牛理生態(tài)學(xué)與飼草栽培所在學(xué)院：農(nóng)學(xué)院論文完成日期：２０１８年５月

2、獨(dú)創(chuàng)性聲明Ｉ本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研宄成果，也不包含為獲得寧夏大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使一用過(guò)的材料。與我同工作的老師、同學(xué)、朋友對(duì)本研宄所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研宄生簽名：時(shí)間：》年Ｇ月２曰＞１關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解寧夏大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定：，即學(xué)校有權(quán)保留送交，，可以采用影印論文的復(fù)印件和磁盤允許論文被查閱和借閱、縮印

3、或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意寧夏大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。（保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）＜＾日研宂生簽名：２〇：％時(shí)間訟年月＜厶０’導(dǎo)師簽名：：時(shí)間ｒ年《月，日，ＩＩ摘要一首蓿（Ｍｅｄ／ｃａｏｓａｔＶｆｌＬ．）是全世界分布最廣的種多年生豆科牧草，也是我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)ｇ中的重要詞草飼料，具有產(chǎn)量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，氨基酸組成均衡，畜禽均喜食等特性。隨著生態(tài)文明建設(shè)和現(xiàn)代草畜產(chǎn)業(yè)發(fā)展，迫切需求節(jié)水抗旱和耐鹽苜蓿新品種。利用分子育種手段是加快培育苜蓿耐鹽

4、新品種的有效途徑。ＳＯＳ（ＳａｌｔＯｖｅｒｌｙＳｅｎｓｉｔｉｖｅ，ＳＯＳ）家族基因具有調(diào)控離子平衡作用，己在擬南芥，、水稻、煙草和草坪草等植物中驗(yàn)證具有提高耐鹽性功能但目前應(yīng)用該家族基因進(jìn)行苜蓿耐鹽性改良報(bào)道較少。本研究基于苜蓿高頻再生體系的建立，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ＳＯＳ家族多基因（ＳＣＷ２和ＳＯ幻）遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了耐鹽轉(zhuǎn)基因株系，并在室內(nèi)和田間進(jìn)行了耐鹽性鑒定和評(píng)價(jià)：。主要結(jié)果如下“．通過(guò)愈傷組織和子葉節(jié)離體培養(yǎng)１，構(gòu)建了高頻的愈傷組織再生體系和子葉節(jié)再生體系。以杰”“”“”“”“”“”“”“”克林、阿爾岡金、金皇后

5、１、金皇后２、皇后２０００、柏拉圖、三得利、甘農(nóng)３號(hào)、“”“”敖漢和隴東１０個(gè)苜蓿品種為研究對(duì)象，對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)分化，不定芽誘導(dǎo)伸長(zhǎng)和生根“杰克林”等影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研宄，研究表明下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)］００％，分化率高“”達(dá)６９，．７５％；金皇后２子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)率達(dá)７６％分化率達(dá)７１％；生根率高達(dá)９６％？２．探討了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的因素，優(yōu)化了苜蓿多基因遺傳轉(zhuǎn)化體＇１－系。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜蓿多基因遺傳轉(zhuǎn)化中，１００ｘｍｏｌｉ的乙酰丁香酮可使轉(zhuǎn)化率提髙２３倍ｆ；最佳菌液侵染０￡）？？值在０

6、．６；最適侵染時(shí)間為２０ｍｉｎ；頭孢霉素作為最佳除菌劑其最適濃度為５００ｍｌ１Ｇｌ１；篩選劑ｌｕ最適選擇壓為５．０ｍ；后期培養(yǎng)可適當(dāng)降低除菌劑和篩選劑的濃度ｇｇ。的－３、，．對(duì)獲得１２株除草劑抗性植株進(jìn)行ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ雜交及ＲＴＰＣＲ分子檢測(cè)陽(yáng)性植株５株，＊，且沉漢５基因和基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)證明外源多基因己經(jīng)整合到苜蓿的基因組之中。－對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系Ｔ２－１采用嫩枝扦插技術(shù)進(jìn)行盆栽無(wú)性擴(kuò)繁，獲得了６０株轉(zhuǎn)基因Ｔ２１株系群體材料。４－，證明轉(zhuǎn)基因株系較野生型具有明顯的．對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因株系Ｔ２］進(jìn)行了室內(nèi)盆栽

7、耐鹽性鑒定－耐鹽性。采用０、１００、２００和３００ｍＭＮａＣｌ８ｄ后，轉(zhuǎn)基因株系Ｔ２１的表型脅迫處理、株高、＋＋葉綠素２、葉面積、鮮草產(chǎn)量、莖粗和分枝數(shù)等農(nóng)藝性狀均優(yōu)于野生型對(duì)照；葉片Ｋ、Ｃａ和Ｐｒｏ＋含量及ＳＯＤ、ＰＯＤ和ＣＡＴ酶活性增加并高于野生型對(duì)照，Ｎａ積累量、ＭＤＡ含量和相對(duì)電導(dǎo)率均低于野生型對(duì)照－。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因Ｔ２１株系的抗氧化保護(hù)酶活性增加，清除了活性氧傷害；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累增加，提高了滲透調(diào)節(jié)能力，維持了膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，；膜脂過(guò)氧化程度較低這可＋＋＋能是由于沉石途徑基因的表達(dá)調(diào)控將Ｎａ排出胞外，選擇性吸收更多的Ｋ，維

8、持細(xì)胞內(nèi)Ｎａ和＋的動(dòng)態(tài)平衡，毒害，從而提高轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽性減輕Ｎａ。－