根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

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1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展摘要：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)因具有操作簡便，轉(zhuǎn)化效率高，容易得到單拷貝隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)化子，并且轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等特點(diǎn)而成為近年來絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的主要研究手段之一，也使該系統(tǒng)有可能成為絲狀真菌基因組研究的有力工具。本文就根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化絲狀真菌原理、過程、種類、影響轉(zhuǎn)化效率的因素及其應(yīng)用等方面進(jìn)行了綜述?！　［關(guān)鍵詞]］根癌農(nóng)桿菌；絲狀真菌；遺傳轉(zhuǎn)化絲狀真菌(（filamentousfungi))是真菌中一個很大類群，通常指那些菌絲體比較發(fā)達(dá)而又不產(chǎn)生大型子實體的真菌。其在自

2、然條件下常引起食物、工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的霉變和植物的真菌病害,，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有重要作用。絲狀真菌中很多種具有重要的經(jīng)濟(jì)價值,，還有一些是昆蟲、植物、動物和人類的重要致病菌,，如綠僵菌(（Metarhiziumanisopliae))、稻瘟菌(（Magnaporthegrisea))和煙曲霉(（Aspergillusfumigatus))等.。而構(gòu)巢曲霉(（Aspergillusnidulans))和粗糙脈孢霉(（Neurosporacrassa))由于結(jié)構(gòu)簡單,，通常被作為真核微生物的“模式”種

3、用于基礎(chǔ)研究[［11]］.。由于絲狀真菌在經(jīng)濟(jì)上和科學(xué)中的重要性,，多年來一直被廣泛地研究.。近年來發(fā)展了很多轉(zhuǎn)化的方法,，但并非所有方法都適用于絲狀真菌.。以往絲狀真菌的常規(guī)轉(zhuǎn)化方法有PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，限制酶介導(dǎo)的插入突變(（Restrictionenzyme-mediatedinsertional,，REMI))等,，但是這些轉(zhuǎn)化技術(shù)或需要制備原生質(zhì)體、或轉(zhuǎn)化效率低．阻礙了它們在研究絲狀真菌功能基因中的應(yīng)用。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系(（Agrobacteriumtumefaciensmediatedt

4、ransformation,，ATMT))克服了這些缺點(diǎn)．為絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化和功能基因研究提供了有力的工具，現(xiàn)已被廣泛地運(yùn)用于絲狀真菌的遺傳操作目前已經(jīng)實現(xiàn)了對泡盛曲霉(（Aspergilusawamori))、粗糙脈孢菌(（Neurosporacrassa))、尖孢鐮刀菌(（Fusariumoxysporum))和瓜類炭疽(（Colletotrichumlagenarium))等6600多種真菌的遺傳轉(zhuǎn)化[［22]］。11、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的絲狀真菌的原理和種類根癌農(nóng)桿菌是革蘭氏陰性土壤桿菌．自然情況下

5、它可通過傷口侵入植物導(dǎo)致受傷部位產(chǎn)生癭瘤，并將其T-DNA序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并整合到植物染色體上[［53］1．利用這一原理得到第一批能表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。根癌農(nóng)桿菌正被廣泛地應(yīng)用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化中。在大腸桿菌與酵母菌能夠通過接合的方式將前者的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到后者［4］和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物等現(xiàn)象的啟下，Bundock等人嘗試用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌可以轉(zhuǎn)化釀酒酵母(（Saccharomycescerevisiae))[［651］，顯示了根癌農(nóng)桿菌能夠轉(zhuǎn)化除植物以外的其他物種。許多科研工作者也紛紛投

6、入到利用該方法對其他真菌的遺傳轉(zhuǎn)化的工作中，拓寬了根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化范圍。與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化相似，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌時，同樣需要vir(（virulence))基因的活化，即T-DNA(（transferredDNA))轉(zhuǎn)移至真菌同植物一樣是依賴于毒性系統(tǒng)的。Michieise等利用一系列毒性蛋白基因缺失的農(nóng)桿菌突變體轉(zhuǎn)化Aspergillusawamori，以闡明不同毒性蛋白在T-DNA轉(zhuǎn)移至A．a(chǎn)wamori的作用。研究結(jié)果顯示，任何一個調(diào)節(jié)蛋白(（VirA，VirG))，或者是轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白(（virB)

7、)，或是T鏈復(fù)合物形成蛋白(（VirD，VirC，VirE22))的失活都會嚴(yán)重的降低轉(zhuǎn)化效率。這一結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)A．a(chǎn)wamori的高效轉(zhuǎn)化需要一個完整的T-DNA轉(zhuǎn)移機(jī)制。這些都證明農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高等和低等真核生物的機(jī)理具有一定的保守性。然而，Michielse等的研究也顯示，VirE33，VirH，VirF毒性蛋白，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化A．a(chǎn)wamori的過程中并不是必需的。另有研究表明控制農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞附著的chvA，chvB及exoC基因在酵母的轉(zhuǎn)化中也并非必不可少。因此，根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌的機(jī)理還需要由更

8、多相關(guān)的試驗研究來闡明。22、絲狀真菌ATMT轉(zhuǎn)化大致過程絲狀真菌ATMT遺傳轉(zhuǎn)化過程比較簡單,，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備,，且基本相同，依次為構(gòu)建二元載體、活化根癌農(nóng)桿菌、準(zhǔn)備真菌分生孢子和共轉(zhuǎn)化，大致如下:：根據(jù)實驗?zāi)康臉?gòu)建二元載體，挑取攜有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌單菌落到含有相應(yīng)抗生素的基本培養(yǎng)(（minimalmedium,，MM))中培養(yǎng)過夜;；收集菌體用誘導(dǎo)培養(yǎng)液(（