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《根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的反義waxy基因?qū)Χi稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的反義waxy基因?qū)Χi稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究姓名：劉南南申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：朱延明2003.5.1摘要車研究以廣東地區(qū)三個常規(guī)秈稻品種和兩個不育系品種為材料，系統(tǒng)地探討了影響秈稻植株再生體系的主要因素，建立了穩(wěn)定，高效的秈稻植株再生體系；構(gòu)建了適臺于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化秈稻的植物表達(dá)載體：應(yīng)用正交實驗設(shè)計探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素，建立了秈稻的遺傳轉(zhuǎn)化體系；將反義水稻蠟質(zhì)(waxy)基因和GUS基因的融臺基因?qū)攵i稻，并進(jìn)行了初步檢測。(本研究主要結(jié)論如下：＼1．反義waxy基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建本實驗構(gòu)建了一
2、個植物表達(dá)載體卡盒和一個植物表達(dá)載體，植物表選載體卡盒p13WG3．1含有waxy基因上游調(diào)控序列調(diào)控的GUS基因，選擇標(biāo)記基因為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，可作預(yù)實驗使用；植物表達(dá)載體p13W4中的反義waxy-GUS融合基因由waxy基因上游調(diào)控序列調(diào)控，作為目的基因轉(zhuǎn)化的材料。2．秈稻植株再生體系的建立a．2，4-D濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響探討了2，4一D濃度為卜5m∥I．對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，各品種均在2，4-D濃度為2mgjL的NB培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最高，分別為粵香占79．17％、粵豐占62．50％、培矮64S12．50％、GD-1S70．00％、粵泰B95．8
3、3％。b．基因型對愈傷組織誘導(dǎo)的影響五個品種在相同的2，4-D濃度下愈傷組織誘導(dǎo)辜存在顯著差異，最高的為粵泰B95．83％，最低的為培矮64S12．50％。c．接種方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響采用平放和斜插兩種接種方式，平放方式好于斜插方式，愈傷組織誘導(dǎo)率最太差異可達(dá)60％。d．培養(yǎng)基成分對培矮64S愈傷組織誘導(dǎo)的影響對愈傷組織誘導(dǎo)事較低的不育系品種培矮64S，通過對基本培養(yǎng)基種類、有機(jī)物的添加、有機(jī)碳源的使用、植物生長調(diào)節(jié)劑及微量元素的調(diào)節(jié)的探討，最終確定培矮64S愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MB+2，4-D2mg／L+BA0．5rag／L+麥芽塘309／L，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)56
4、．48％。e．影響不定芽分化的因素采用二步分化法，對愈傷組織進(jìn)行預(yù)分化處理和干燥處理，及通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓使不定芽分化率大大提高，五個品種不定芽的分化率存在差異，均在80％左右。f．低濃度2，4-D光下誘導(dǎo)愈傷組織快速成苗低濃度2，4-D光下誘導(dǎo)的愈傷組織直接轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中可一次直接分化，分V東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文化率在80％以上，大大縮短了培養(yǎng)周期。3．農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立a．篩選壓力的確定確定了五個品種的愈傷組織的潮霉素篩選濃度為20mg／L；四個品種的成熟胚的潮霉素篩選濃度為10rag／L；四個品種的種子萌發(fā)的潮霉素篩選濃度為150rag．／L。
5、b．除苗劑濃度的確定除菌劑選用先鋒霉素，實驗0-600mg／L先鋒霉素對農(nóng)桿菌的抑制作用，晟后確定除菌濃度為500rrI嘰。。c不同基因型對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響不同基因型的GUS基因瞬時表達(dá)率存在差異，分別為粵香占17．65％、粵豐占25．88％、培矮64S12．70％、GD-1S49．30％。d、影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的主要因素的優(yōu)化用正交實驗設(shè)計探討了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化秈稻愈傷組織過程中的其它影響因素，確定的最優(yōu)實驗組合為：侵染菌液濃度為OD600=1．0，共培養(yǎng)緩沖介質(zhì)為NB培養(yǎng)基，共培養(yǎng)時AS的添加濃度為300p．mol／L，共培養(yǎng)時添加109el葡萄糖，侵染方法采用不振蕩法，愈傷
6、組織預(yù)培養(yǎng)時不添加As，共培養(yǎng)pH值為5．8．共培養(yǎng)時問為3天，侵染時問為30分鐘。e，GUS檢測四個品種的轉(zhuǎn)化愈傷組織經(jīng)GUS組織化學(xué)染色分析，均檢測到waxy基因上游調(diào)控序列調(diào)控的反義waxy和GUS融合基因的表達(dá)，初步證實目的基因已轉(zhuǎn)入秈稻愈傷組織中。f初步嘗試了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化秈稻花藥和農(nóng)桿菌介鄹去與種子浸泡法相結(jié)合轉(zhuǎn)化秈稻成熟胚，取得了一定進(jìn)展，尚需進(jìn)一步探討。r，／關(guān)鍵詞秈稻；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；反義waxy基因：植株再生：遺傳轉(zhuǎn)化StudiesontransformationofantisensewaxygeneintoindicaricebyAgrobacteriu
7、mtumfacienceAbstractInthisresearch、threevarietiesofInd／cariceandtwosterileIineswerechosenasthematerials．ThefactorsaffectingregenerationwerestudiedsystematicallyandsteadyregenerationsystemWaSesrablished。AplantexpressionvectorusedforthetransformationofIndicarice
