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《根癌農(nóng)桿菌介導的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、根癌農(nóng)桿菌介導的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化研摘要：以小麥栽培品種鄭麥9023成熟胚半胚愈傷組織作為受體材料，通過農(nóng)桿菌菌株GV3101將目的基因?qū)胧荏w材料并對轉(zhuǎn)化過程進行了優(yōu)化。考查了MS培養(yǎng)基中NH4N03濃度對組織培養(yǎng)的影響，以及高滲處理對轉(zhuǎn)化過程的作用。結(jié)果顯示，2?5倍的NH4NO3濃度可明顯提高愈傷組織再生率，高滲處理對愈傷組織再生率的提高也有幫助。經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定，共得到了4株轉(zhuǎn)基因小麥植株，平均轉(zhuǎn)化效率為0?18%。關鍵詞：小麥；成熟胚；農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化中圖分類號：s512.1文獻標識碼：A文章編號:0439-811417-3637-03Agrobacterium—media
2、TransformationofWheatMatLIYan—chuanAbstract：Agrobacterium—transformationwasconductedbyusingeXp1antwheatmaturemediatedAgrobacteroumstrainGV3101sderivedfromembryosofZhengmai9023asreceptor；andthetransformationprocesswasoptimized?TheeffectofNH4N03concentrationandosmotictreatmentwasstudied.Theresu1ts
3、howedthat2.5timesofNH4N03concentrationincal1usinductionmediumandosmotictreatmentcouldincreasetheregenerationrateofcallus?AccordingtotheresistanceidentificationandPCRidentification,4transgenicwheatplantswereobtainedwiththeaveragetransformationefficiencyof0?18%.Keywords：wheat；matureembryo；Agrobact
4、erium；transformation1997年，Cheng等［1］首次用農(nóng)桿菌介導法獲得可育的轉(zhuǎn)基因小麥植株。幾年后，夏光敏等［2］、葉興國等［3］也分別報道利用農(nóng)桿菌法獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。隨后越來越多的研究機構(gòu)對農(nóng)桿菌介導的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法作了更加細致與深入的研究［4-8］,使得該方法的轉(zhuǎn)化效率不斷提高。但上述報道大多用小麥幼胚及其誘導產(chǎn)生的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，雖然小麥幼胚再生能力強，但取材在時間和空間上受到很大限制，適宜轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)難以掌握，轉(zhuǎn)化周期也比較長。相比幼胚，成熟胚取材方便,生理狀態(tài)一致，不受生長季節(jié)限制，是組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化理想的外植體。本研究以小麥成熟胚誘導
5、的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，在已有研究基礎上［9—11］選擇根癌農(nóng)桿菌介導小麥遺傳轉(zhuǎn)化的幾個重要影響因素，進行比較與優(yōu)化，旨在為進一步建立和優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎。1材料與方法1.1試驗材料小麥品種鄭麥9023以及質(zhì)粒pTRAkc-BAR-UT-Rs-D2和根癌農(nóng)桿菌GV3101均由華中農(nóng)業(yè)大學麥類分子生物學實驗室提供。1.2試驗方法1.2.1培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)基含MS基本培養(yǎng)基［12］、肌醇100mg/L、天門冬氨酸134mg/L、脯氨酸115mg/L.MES1.95g/L.2,4-D2mg/L.麥芽糖40g/L、植物凝膠5g/L；同時設計了3種NH4N03濃度修飾
6、的誘導培養(yǎng)基。浸染培養(yǎng)基、分化篩選培養(yǎng)基、生根篩選培養(yǎng)基及生根壯苗培養(yǎng)基等參照文獻配制［9,13］。1.2.2種子表面消毒及預處理選取成熟飽滿、顏色和大小相對一致的小麥成熟種子，用70%的乙醇浸泡5min,無菌水沖洗2?3次，再經(jīng)0.1%HgC12浸泡15min,無菌水沖洗6?8次后，置于含8mg/L2,4-D溶液的無菌三角瓶中33°C浸泡5h。預處理后的種子用70%的乙醇浸泡1min,無菌水沖洗2?3次，再經(jīng)0.1%的日gCl2浸泡5min,無菌水沖洗3?4次。1.2.3愈傷組織的誘導用左手拿錫子夾住已浸泡過的成熟種子無胚的一端，右手拿手術刀將成熟胚縱切成兩半后，將胚剝出，切面向下放
7、置于誘導培養(yǎng)基上，°C暗培養(yǎng)1?2?4農(nóng)桿菌接種菌液的準備挑取含目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101單菌落于10mL含25mg/Lkan>100mg/Lrif和100mg/Lcab的YEE培養(yǎng)基中，28°C.220r/min暗培養(yǎng)過夜。吸取1mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mL含25mg/Lkan、100mg/Lrif和100mg/Lcab的YEB培養(yǎng)基中，28°C>220r/min繼續(xù)暗培養(yǎng)至0D600nm=0?8?1.0。將菌液轉(zhuǎn)至無菌離心管中,4500r/mi
