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《根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化研摘要：以小麥栽培品種鄭麥9023成熟胚半胚愈傷組織作為受體材料，通過(guò)農(nóng)桿菌菌株GV3101將目的基因?qū)胧荏w材料并對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。考查了MS培養(yǎng)基中NH4N03濃度對(duì)組織培養(yǎng)的影響，以及高滲處理對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的作用。結(jié)果顯示，2?5倍的NH4NO3濃度可明顯提高愈傷組織再生率，高滲處理對(duì)愈傷組織再生率的提高也有幫助。經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定，共得到了4株轉(zhuǎn)基因小麥植株，平均轉(zhuǎn)化效率為0?18%。關(guān)鍵詞：小麥；成熟胚；農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化中圖分類(lèi)號(hào)：s512.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào):0439-811417-3637-03Agrobacterium—media
2、TransformationofWheatMatLIYan—chuanAbstract：Agrobacterium—transformationwasconductedbyusingeXp1antwheatmaturemediatedAgrobacteroumstrainGV3101sderivedfromembryosofZhengmai9023asreceptor；andthetransformationprocesswasoptimized?TheeffectofNH4N03concentrationandosmotictreatmentwasstudied.Theresu1ts
3、howedthat2.5timesofNH4N03concentrationincal1usinductionmediumandosmotictreatmentcouldincreasetheregenerationrateofcallus?AccordingtotheresistanceidentificationandPCRidentification,4transgenicwheatplantswereobtainedwiththeaveragetransformationefficiencyof0?18%.Keywords：wheat；matureembryo；Agrobact
4、erium；transformation1997年，Cheng等［1］首次用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得可育的轉(zhuǎn)基因小麥植株。幾年后，夏光敏等［2］、葉興國(guó)等［3］也分別報(bào)道利用農(nóng)桿菌法獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。隨后越來(lái)越多的研究機(jī)構(gòu)對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法作了更加細(xì)致與深入的研究［4-8］,使得該方法的轉(zhuǎn)化效率不斷提高。但上述報(bào)道大多用小麥幼胚及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，雖然小麥幼胚再生能力強(qiáng)，但取材在時(shí)間和空間上受到很大限制，適宜轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)難以掌握，轉(zhuǎn)化周期也比較長(zhǎng)。相比幼胚，成熟胚取材方便,生理狀態(tài)一致，不受生長(zhǎng)季節(jié)限制，是組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化理想的外植體。本研究以小麥成熟胚誘導(dǎo)
5、的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，在已有研究基礎(chǔ)上［9—11］選擇根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的幾個(gè)重要影響因素，進(jìn)行比較與優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步建立和優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料小麥品種鄭麥9023以及質(zhì)粒pTRAkc-BAR-UT-Rs-D2和根癌農(nóng)桿菌GV3101均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類(lèi)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。1.2試驗(yàn)方法1.2.1培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基含MS基本培養(yǎng)基［12］、肌醇100mg/L、天門(mén)冬氨酸134mg/L、脯氨酸115mg/L.MES1.95g/L.2,4-D2mg/L.麥芽糖40g/L、植物凝膠5g/L；同時(shí)設(shè)計(jì)了3種NH4N03濃度修飾
6、的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。浸染培養(yǎng)基、分化篩選培養(yǎng)基、生根篩選培養(yǎng)基及生根壯苗培養(yǎng)基等參照文獻(xiàn)配制［9,13］。1.2.2種子表面消毒及預(yù)處理選取成熟飽滿、顏色和大小相對(duì)一致的小麥成熟種子，用70%的乙醇浸泡5min,無(wú)菌水沖洗2?3次，再經(jīng)0.1%HgC12浸泡15min,無(wú)菌水沖洗6?8次后，置于含8mg/L2,4-D溶液的無(wú)菌三角瓶中33°C浸泡5h。預(yù)處理后的種子用70%的乙醇浸泡1min,無(wú)菌水沖洗2?3次，再經(jīng)0.1%的日gCl2浸泡5min,無(wú)菌水沖洗3?4次。1.2.3愈傷組織的誘導(dǎo)用左手拿錫子夾住已浸泡過(guò)的成熟種子無(wú)胚的一端，右手拿手術(shù)刀將成熟胚縱切成兩半后，將胚剝出，切面向下放
7、置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，°C暗培養(yǎng)1?2?4農(nóng)桿菌接種菌液的準(zhǔn)備挑取含目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101單菌落于10mL含25mg/Lkan>100mg/Lrif和100mg/Lcab的YEE培養(yǎng)基中，28°C.220r/min暗培養(yǎng)過(guò)夜。吸取1mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mL含25mg/Lkan、100mg/Lrif和100mg/Lcab的YEB培養(yǎng)基中，28°C>220r/min繼續(xù)暗培養(yǎng)至0D600nm=0?8?1.0。將菌液轉(zhuǎn)至無(wú)菌離心管中,4500r/mi
