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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)第22卷第5期中國(guó)生物工程雜志JouRNALoFcHINEsEBIoTEcHNoLoGY2002年10月根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展”翟簍黧技磐重耋=∞3A(西南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心重慶400716)u、IS△摘要根癌農(nóng)桿茼介導(dǎo)的真茵遺傳轉(zhuǎn)化是近年來(lái)發(fā)展的一種新方法，與其它方法相比，該方法具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高和易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子等特點(diǎn)。目前，在根癌農(nóng)桿茵介導(dǎo)下已實(shí)現(xiàn)了多個(gè)屬種真茼的遺傳轉(zhuǎn)化，顯示出良好的應(yīng)用前景。綜述了根癌農(nóng)桿茵介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化機(jī)理和rr．剛A在真菌細(xì)胞中的存在方式等方面的研宄結(jié)果，并展望這一方法的應(yīng)
2、用前景。關(guān)鍵詞根癌農(nóng)桿茵真菌遺傳轉(zhuǎn)化真菌在自然界具有重要的地位，它是不同生態(tài)環(huán)境中的最初分解者之一，同時(shí)真菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。如構(gòu)巢曲霉(^{胛，州fw鯽弛mo^)由于具有很強(qiáng)的生產(chǎn)同源、異源蛋白的能力、GRAs(胛聊mZrecog“洫d∞s啦竹)和成熟的發(fā)酵工藝等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于食品和食品加工行業(yè)。殺蟲(chóng)真菌白僵菌和綠僵菌廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)防治。但是，從自然界直接分離的菌株和通過(guò)常規(guī)育種得到的菌株在多種性狀上并不能滿足人們的需要，至于通過(guò)常規(guī)方法用真菌生產(chǎn)異源蛋白更是難以實(shí)現(xiàn)。真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的出現(xiàn)為解決
3、這些問(wèn)題提供了有效的途徑。自從1973年Mishm等首次報(bào)道真菌遺傳轉(zhuǎn)化以來(lái)”‘21，真菌特別是酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化取得了很大的進(jìn)展。但目前廣泛采用的真菌轉(zhuǎn)化方法主要有PEG．cack法、電激法和基因槍法，這些方法大都以原生質(zhì)體為受體。除了制備原生質(zhì)體過(guò)程復(fù)雜、重復(fù)性差外，這些方法最大的問(wèn)題在于轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率低”1。其中轉(zhuǎn)化效率低已成為制約真菌遺傳轉(zhuǎn)化的瓶頸問(wèn)題一-。針對(duì)這一問(wèn)題．許多學(xué)者提出了一些改進(jìn)方法和新方法，其中最有效的是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌*國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(拍3)資助項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào)：200l^^214051))**通訊作
4、者，聯(lián)系電話：023—68251883．電于信箱：pely柚@mmen遺傳轉(zhuǎn)化。根癌農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，它能夠在植物的受傷部位侵染植物細(xì)胞，將T．DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并整合進(jìn)植物的基因組，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在大腸桿菌與酵母菌能夠通過(guò)接合的方式將前者的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到后者”’和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物等現(xiàn)象的啟發(fā)下．Bundock等人嘗試用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌遺傳轉(zhuǎn)化，并取得了成功”。。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化法具有效率高，成本低，操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)”。1。1根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的真菌種類自1995年Bundock等首
5、次成功進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化以來(lái)，到目前為止已在10多種真菌上取得成功。已轉(zhuǎn)化成功的真菌見(jiàn)表1。2根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的機(jī)理為了方便說(shuō)明根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的機(jī)理，有必要將其介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化的機(jī)理作一介紹。根癌農(nóng)桿菌將T—DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞主要是依賴于Ti質(zhì)粒上一系列vir基因的表達(dá)。virA基因編碼的蛋白A結(jié)合植物傷口釋放的單糖和酚類物質(zhì)后自身激化，其保守的組氨酸殘基被磷酸化。磷酸化的蛋白A將其上的磷酸萬(wàn)方數(shù)據(jù)第5期方衛(wèi)國(guó)等：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展4l鹽轉(zhuǎn)化到viIc蛋白的天冬氨酸殘基上，激活vi以
6、蛋白。激活的virG結(jié)合到vir基因啟動(dòng)子的特定區(qū)域，打開(kāi)virB、c、D、EH等幾個(gè)基因的表達(dá)。其中virDl，virD2共同作用下，切開(kāi)T_DNA的邊界區(qū)域，virD2蛋白在切割后還結(jié)合在T-DNA5’端，其c一端的N【ss序列(nucleartar辨tin異sequences)將T_DNA導(dǎo)向植物細(xì)胞。virc基因通過(guò)結(jié)合在RB附近的非T—DNA區(qū)域以增強(qiáng)virD2對(duì)RB的切割效率。單鏈結(jié)合蛋白virE結(jié)合到T．DNA單鏈上形成T-DNA復(fù)合體(T—DNAco唧lexs)，在virB的作用下T—DNA復(fù)合體通過(guò)農(nóng)桿菌細(xì)胞膜進(jìn)入植物細(xì)胞
7、后整合到植物的基因組。virF和virH基因?qū)D(zhuǎn)化不同植物品種時(shí)發(fā)揮不同的作用。另外，根癌農(nóng)桿菌基因組的chvA、chvB、“oc等毒性基因在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中起一定作用”1。哀l目前利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化成功獲得轉(zhuǎn)基因曹株的真蕾與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化相似，它介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化同樣需要vir基因的表達(dá)。只有在根癌農(nóng)桿菌與受體細(xì)胞的共培養(yǎng)基中含有乙酰丁香酮(Asacelosy打n舶ne)時(shí)轉(zhuǎn)化才能發(fā)生。virA、vi以、virDl，virD2、virE、virB和virC中任何一個(gè)基因發(fā)生突變都沒(méi)有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的發(fā)生。同時(shí)T．D
8、NA的左右邊界任何一個(gè)發(fā)生缺失T．DNA都不能轉(zhuǎn)移。但是virF和virH的突變體的轉(zhuǎn)化效率改變不明顯”?。Pien等人發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌染色體毒性基因(chvA、chvB和exoc
