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1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化研究 摘要：以小麥栽培品種鄭麥９０２３成熟胚半胚愈傷組織作為受體材料，通過農(nóng)桿菌菌株ＧＶ３１０１將目的基因?qū)胧荏w材料并對轉(zhuǎn)化過程進行了優(yōu)化?？疾榱耍停优囵B(yǎng)基中ＮＨ４ＮＯ３濃度對組織培養(yǎng)的影響，以及高滲處理對轉(zhuǎn)化過程的作用。結(jié)果顯示，２．５倍的ＮＨ４ＮＯ３濃度可明顯提高愈傷組織再生率，高滲處理對愈傷組織再生率的提高也有幫助。經(jīng)抗性篩選和ＰＣＲ鑒定，共得到了４株轉(zhuǎn)基因小麥植株，平均轉(zhuǎn)化效率為０．１８％?！ ￡P(guān)鍵詞：小麥；成熟胚；農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化 中圖分類號：Ｓ５１２．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114
2、17－3637-03 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔＭａｔｕｒｅＥｍｂｒｙｏＴｉｓｓｕｅｓ ?。蹋桑伲幔睿悖瑁酰幔睢 。粒猓螅簦颍幔悖簦海粒纾颍铮猓幔悖簦澹颍椋酰恚恚澹洌椋幔簦澹洌簦颍幔睿螅妫铮颍恚幔簦椋铮睿鳎幔螅悖铮睿洌酰悖簦澹鋌yAgrobacteroumstrainGV3101ｕｓｉｎｇｅｘｐｌａｎｔｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｗｈｅａｔｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆＺｈｅｎｇｍａｉ９０２３ａｓｒｅｃｅｐｔｏｒ；ａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓ
3、ｓｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｗａｓｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ2.5timesｏｆＮＨ４ＮＯ３ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃａｌｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｃouldｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆcallus．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰＣＲidentification，４ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
4、ｃｗｈｅａｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｖｅｒａｇｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙof０．１８％． ?。耍澹鳎铮颍洌螅海鳎瑁澹幔?；ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ?。保梗梗纺辏茫瑁澹睿绲龋郏保菔状斡棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得可育的轉(zhuǎn)基因小麥植株。幾年后，夏光敏等［２］、葉興國等［３］也分別報道利用農(nóng)桿菌法獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。隨后越來越多的研究機構(gòu)對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法作了更加細致與深入的研究［４－８］，使得該方法的轉(zhuǎn)化效率不斷提高。但上述報道
5、大多用小麥幼胚及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，雖然小麥幼胚再生能力強，但取材在時間和空間上受到很大限制，適宜轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)難以掌握，轉(zhuǎn)化周期也比較長。相比幼胚，成熟胚取材方便，生理狀態(tài)一致，不受生長季節(jié)限制，是組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化理想的外植體。本研究以小麥成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，在已有研究基礎(chǔ)上［９－１１］選擇根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的幾個重要影響因素，進行比較與優(yōu)化，旨在為進一步建立和優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)?！ 。辈牧吓c方法 ?。保痹囼灢牧稀 ⌒←溒贩N鄭麥９０２３以及質(zhì)粒ｐＴＲＡｋｃ－ＢＡＲ－ＵＴ－
6、Ｒｓ－Ｄ２和根癌農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類分子生物學(xué)實驗室提供。 ?。保苍囼灧椒ā 。保玻迸囵B(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基含ＭＳ基本培養(yǎng)基［１２］、肌醇１００ｍｇ／Ｌ、天門冬氨酸１３４ｍｇ／Ｌ、脯氨酸１１５ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ１．９５ｇ／Ｌ、２，４－Ｄ２ｍｇ／Ｌ、麥芽糖４０ｇ／Ｌ、植物凝膠５ｇ／Ｌ；同時設(shè)計了３種ＮＨ４ＮＯ３濃度修飾的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。浸染培養(yǎng)基、分化篩選培養(yǎng)基、生根篩選培養(yǎng)基及生根壯苗培養(yǎng)基等參照文獻配制［９，１３］?！ 。保玻卜N子表面消毒及預(yù)處理選取成熟飽滿、顏色和大小相對一致的小麥成熟種子，用７０％的乙醇浸泡５ｍｉｎ，無菌水
7、沖洗２～３次，再經(jīng)０．１％ＨｇＣｌ２浸泡１５ｍｉｎ，無菌水沖洗６～８次后，置于含８ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ溶液的無菌三角瓶中３３℃浸泡５ｈ。預(yù)處理后的種子用７０％的乙醇浸泡１ｍｉｎ，無菌水沖洗２～３次，再經(jīng)０．１％的ＨｇＣl２浸泡５ｍｉｎ，無菌水沖洗３～４次?！ 。保玻秤鷤M織的誘導(dǎo)用左手拿鑷子夾住已浸泡過的成熟種子無胚的一端，右手拿手術(shù)刀將成熟胚縱切成兩半后，將胚剝出，切面向下放置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，℃暗培養(yǎng)１４ｄ?！ 。保玻崔r(nóng)桿菌接種菌液的準備挑取含目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌ＧＶ３１０１單菌落于１０ｍＬ含２５ｍｇ／Ｌkan、１００ｍｇ／Ｌrｉｆ和１０
8、０ｍｇ／Ｌcａｂ的ＹＥＢ培養(yǎng)基中，２８℃、２２０ｒ／ｍｉｎ暗培養(yǎng)過夜。吸?。保恚膛囵B(yǎng)物轉(zhuǎn)入５０ｍＬ含２５ｍｇ／Ｌkan、１００ｍｇ／Ｌrｉｆ和１００ｍｇ／Ｌcａｂ的
