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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)凝集素基因轉(zhuǎn)化柑橘遺傳體系的研究姓名：何溫紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：丁芳201206根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)凝集素基因轉(zhuǎn)化柑橘遺傳體系的研究摘要本試驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，以模式植物煙草(Nicotianabenthamiana)和蕓香科植物甜橙(Citrussinensis)、夏橙(CitrusNatsudaidaiHayata)為材料，成功建立了凝集素基因的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，取得的主要試驗(yàn)結(jié)果如下：l枳殼凝集素基因克隆及分析，采用TA克隆法獲得了枳殼凝集素基因完整ORF序列，其全長(zhǎng)為801bp，編碼一個(gè)267個(gè)氨基酸的開放閱讀框。將該基因
2、插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)，獲得重組載體pET-28a(+)．PTA．NHl5，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在1mmoFLIPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá)，SDS．PAGE分析結(jié)果表明，pET-28a(+)．PTA．NHl5基因在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了表達(dá)，大小為29kDa。2枳殼凝集素基因植物表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)植物表達(dá)載體pCAMBIAl301S上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，利用帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增得到編碼完整開放閱讀框的枳殼凝集素基因，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHAl05感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，該基因已成功構(gòu)建到了植物表達(dá)載體pCAMBIAl301S上。3枳殼及外源半夏凝集素基因遺傳轉(zhuǎn)
3、化技術(shù)體系建立通過試驗(yàn)條件的優(yōu)化，最終分別建立了煙草(Nicotianabenthamiana)和柑橘(Citrus)的凝集素基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系：試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草葉盤在農(nóng)桿菌侵染液中侵染10min，MS(附加100mMol／LAS)共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d，MS選擇培養(yǎng)基(附加400mg／L頭孢霉素Cef+卡那霉素Kan50mg／L)中進(jìn)行選擇培養(yǎng)時(shí)，抗性芽再生率較高，為92．5％，抗性芽在1／2MS+200mg／Lcef+0．3mgmNAA生根培養(yǎng)基中成功誘導(dǎo)生根；柑橘莖段在農(nóng)桿菌侵染液中侵染30min，MT共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，MT選擇培養(yǎng)基(附加Kan50mg／L)上進(jìn)行選擇培養(yǎng)時(shí)
4、，抗性芽再生率較高為88．2％，且抗性芽在1／2MT(附加活性炭0．05g／L)培養(yǎng)基上生根率較高，為6．33％。經(jīng)潮霉素(Hyb)抗性篩選后，對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的再生植株進(jìn)行Southernblot驗(yàn)證，目前已得到轉(zhuǎn)枳殼凝集素PoncirusTrifoliataAgglutinin的煙草植株為15株，柑橘植株5株，轉(zhuǎn)半夏凝集素PinelliaTemataAgglutimn的煙草植株9株，柑橘2株。關(guān)鍵詞：柑橘，凝集素基因，SDS．PAGE，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，Southemblot華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士研究生學(xué)位論文ABSTRACTGenetictransformationsystems
5、ofcitrusarenecessaryrequirementfortlleintroductionofusefulgenesintospecificcultivars．ThisresearchpresentsaprotocolforinvitroregenerationandgenetictransformationofC．sinensisandCitrusNatsudaidaiHayatausingstermsegmentsfromthecitrusseedlingsasexplants．TheobtainedresultsareaSfollowings：1ThePoncirusTr
6、ifoliataAgglutinin(PTA)genecloningandanalysisThePoncirusTrifoliataAgglutiningeneWasobtainedbytheTAcloning，whichis801bpandencodesaproteinof267aminoacids．ThecompleteOpenReadingFrame(ORF)ofPTAWasinsertedintoprokaryoticexpressionvectorpET-28a(+)．TherecombinantplasmidsweredenotedaspET-28a-PTA-NH15andi
7、ntroducedintoE．colistrainBL21(DE3)．RecombinatPTAWasinducedby1mMisopropyl-p．D．thiogalactoside(IPTG)．SDS．PAGEanalvsesindicatedthatpET-28a-PTA-NH15geneWasexpressedeffectivelyundertheinductionof1mmol／LIPTGandmolecularweigh
