根癌農桿菌介導的遺傳轉化

《根癌農桿菌介導的遺傳轉化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、根癌農桿菌介導絲狀真菌遺傳轉化的研究進展摘要：根癌農桿菌介導的遺傳轉化系統(tǒng)因具有操作簡便，轉化效率高，容易得到單拷貝隨機插入的轉化子，并且轉化子穩(wěn)定等特點而成為近年來絲狀真菌遺傳轉化的主要研究手段之一，也使該系統(tǒng)有可能成為絲狀真菌基因組研究的有力工具。本文就根癌農桿菌轉化絲狀真菌原理、過程、種類、影響轉化效率的因素及其應用等方面進行了綜述?！　［關鍵詞]］根癌農桿菌；絲狀真菌；遺傳轉化絲狀真菌(（filamentousfungi))是真菌中一個很大類群，通常指那些菌絲體比較發(fā)達而又不產生大型子實體的真菌。其在自

2、然條件下常引起食物、工農業(yè)產品的霉變和植物的真菌病害,，在工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)藥及基礎生物學研究中具有重要作用。絲狀真菌中很多種具有重要的經濟價值,，還有一些是昆蟲、植物、動物和人類的重要致病菌,，如綠僵菌(（Metarhiziumanisopliae))、稻瘟菌(（Magnaporthegrisea))和煙曲霉(（Aspergillusfumigatus))等.。而構巢曲霉(（Aspergillusnidulans))和粗糙脈孢霉(（Neurosporacrassa))由于結構簡單,，通常被作為真核微生物的“模式”種

3、用于基礎研究[［11]］.。由于絲狀真菌在經濟上和科學中的重要性,，多年來一直被廣泛地研究.。近年來發(fā)展了很多轉化的方法,，但并非所有方法都適用于絲狀真菌.。以往絲狀真菌的常規(guī)轉化方法有PEG介導的原生質體轉化，限制酶介導的插入突變(（Restrictionenzyme-mediatedinsertional,，REMI))等,，但是這些轉化技術或需要制備原生質體、或轉化效率低．阻礙了它們在研究絲狀真菌功能基因中的應用。根癌農桿菌介導的轉化體系(（Agrobacteriumtumefaciensmediatedt

4、ransformation,，ATMT))克服了這些缺點．為絲狀真菌的遺傳轉化和功能基因研究提供了有力的工具，現(xiàn)已被廣泛地運用于絲狀真菌的遺傳操作目前已經實現(xiàn)了對泡盛曲霉(（Aspergilusawamori))、粗糙脈孢菌(（Neurosporacrassa))、尖孢鐮刀菌(（Fusariumoxysporum))和瓜類炭疽(（Colletotrichumlagenarium))等6600多種真菌的遺傳轉化[［22]］。11、根癌農桿菌介導遺傳轉化的絲狀真菌的原理和種類根癌農桿菌是革蘭氏陰性土壤桿菌．自然情況下

5、它可通過傷口侵入植物導致受傷部位產生癭瘤，并將其T-DNA序列轉入植物細胞并整合到植物染色體上[［53］1．利用這一原理得到第一批能表達外源基因的轉基因植物。根癌農桿菌正被廣泛地應用到植物的遺傳轉化中。在大腸桿菌與酵母菌能夠通過接合的方式將前者的質粒轉移到后者［4］和農桿菌轉化植物等現(xiàn)象的啟下，Bundock等人嘗試用根癌農桿菌介導酵母菌的遺傳轉化，發(fā)現(xiàn)根癌農桿菌可以轉化釀酒酵母(（Saccharomycescerevisiae))[［651］，顯示了根癌農桿菌能夠轉化除植物以外的其他物種。許多科研工作者也紛紛投

6、入到利用該方法對其他真菌的遺傳轉化的工作中，拓寬了根癌農桿菌的轉化范圍。與根癌農桿菌介導植物遺傳轉化相似，農桿菌轉化真菌時，同樣需要vir(（virulence))基因的活化，即T-DNA(（transferredDNA))轉移至真菌同植物一樣是依賴于毒性系統(tǒng)的。Michieise等利用一系列毒性蛋白基因缺失的農桿菌突變體轉化Aspergillusawamori，以闡明不同毒性蛋白在T-DNA轉移至A．awamori的作用。研究結果顯示，任何一個調節(jié)蛋白(（VirA，VirG))，或者是轉運通道蛋白(（virB)

7、)，或是T鏈復合物形成蛋白(（VirD，VirC，VirE22))的失活都會嚴重的降低轉化效率。這一結果表明，農桿菌介導A．awamori的高效轉化需要一個完整的T-DNA轉移機制。這些都證明農桿菌轉化高等和低等真核生物的機理具有一定的保守性。然而，Michielse等的研究也顯示，VirE33，VirH，VirF毒性蛋白，在農桿菌轉化A．awamori的過程中并不是必需的。另有研究表明控制農桿菌向植物細胞附著的chvA，chvB及exoC基因在酵母的轉化中也并非必不可少。因此，根癌農桿菌轉化真菌的機理還需要由更

8、多相關的試驗研究來闡明。22、絲狀真菌ATMT轉化大致過程絲狀真菌ATMT遺傳轉化過程比較簡單,，不需要復雜的儀器設備,，且基本相同，依次為構建二元載體、活化根癌農桿菌、準備真菌分生孢子和共轉化，大致如下:：根據(jù)實驗目的構建二元載體，挑取攜有雙元載體的根癌農桿菌單菌落到含有相應抗生素的基本培養(yǎng)(（minimalmedium,，MM))中培養(yǎng)過夜;；收集菌體用誘導培養(yǎng)液(（