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《核酸定量與光吸收值》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、260/280；260/230&核酸定量核酸在波長260nm處有最高吸收峰。吸收紫外光的性質是嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能區(qū)分DNA和RNA，只能用來鑒定核酸的純度和含量。蛋白質由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質的吸收高峰在280nm波長處，在260nm處的吸收值公為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm與280nm吸收的比值則在1.
2、9左右。當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降。核酸的定量DNA和RNA都有吸收紫外光的性質，它們的吸收高峰在260nm波長處，每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度，這些由分光光度計內預設的程序執(zhí)行，因此，測試前選擇正確的程序，測試樣品的類型，首先測試空白液，然后再測試樣品，注意輸入樣品稀釋倍數(shù)。如何避免吸光值漂移讀數(shù)不穩(wěn)定可能是
3、實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。核酸本身物化性質溶解核酸的緩沖液的pH值、離子濃度等在測試時，離子濃度太高也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液（如TE）可大大穩(wěn)定讀數(shù)。核酸的吸光值受pH值和緩沖液離子濃度影響。只有在一定的pH值和低離子濃度的條件下（如10mMTris-HClpH8.0），才能得到精確的檢測結果。水的pH值不穩(wěn)定，可能導致檢測誤差。一些緩沖液在紫外范圍內存在自身吸收，為了確保準確測量，請使用與懸
4、浮或洗脫樣品時相同的緩沖液。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素，由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。操作因素如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比
5、色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。各波長具體含義及相關問題1.A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的范圍為0.1至1.0。如果不在此范圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此范圍內；如果吸光度小于0.05，檢查是否存在操作因素（如移液不準確，樣品內有懸浮物等）影響。DNA樣品的A260吸光度值是否>0.1。（請注意，這個值跟儀器無關，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因為樣品中的雜質和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值<0.1）；1.A280nm,A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評
6、估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當于50％蛋白質/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。2.A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑污染，需要純化樣品。A230產(chǎn)生負值主要是由于在很低DNA濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導致的。在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負值會被校正。3.A320nm
7、或A340nm為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應該接近0.0。如果不是，標明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A320一般是0。4.A260/A280和A260/A230是核酸純度的指示值。純度好的DNA或RNA，在pH7-8.5下A260/A280的比值應該在2.0或2.5。純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。當0.5％BSA蛋白質污染時，蛋白污染會導致26
8、0和280的數(shù)值都下降，
