葡聚糖凝膠層析脫鹽

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1、葡聚糖凝膠層析脫鹽生化實驗六學(xué)習(xí)凝膠層析的工作原理和操作方法；掌握利用葡聚糖凝膠層析進行蛋白質(zhì)脫鹽的技術(shù)。目的原理凝膠層析又稱凝膠過濾，分子篩或排阻層析。凝膠過濾的主要裝置是填充有層析介質(zhì)的層析柱。凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利用這種凝膠分子篩對大小、形狀不同的分子進行層析分離，稱凝膠層析。原理1、層析介質(zhì)的特點（1）遇水為不溶解的固相；（2）是化學(xué)惰性物質(zhì)；（3）離子基團含量少；（4）顆粒大小和網(wǎng)眼均勻；（5）機械強度較強；（6）具有可選擇的多種孔徑。原理O目前使用較多的是葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖

2、凝膠及其衍生物。葡聚糖凝膠（商品名稱Sephadex）是最常用的層析介質(zhì)。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷（CH2-CH-CH2Cl）交聯(lián)成的具有三維結(jié)構(gòu)不溶水的高分子化合物。調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑配比，可以獲得網(wǎng)眼大小不同，型號各異的凝膠。原理當(dāng)葡聚糖分子量越小，交聯(lián)劑用量越大，則交聯(lián)度越大，凝膠網(wǎng)眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干膠吸水量（mL）的十倍。例如SephadexG-25其吸水量應(yīng)為2.5mL/g干膠。常用的葡聚糖凝膠有多種規(guī)格，如G-10、G-15、G-25、G-50

3、、G-75、G-100等。原理2、分離原理當(dāng)混合樣液加到凝膠柱上，隨著洗脫劑而通過凝膠柱時，分子大小不同的物質(zhì)受到不同的阻滯作用。顆粒接近或大于網(wǎng)眼的分子，不能進入凝膠的網(wǎng)眼中，在重力作用下它們隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿較短流程向下流動，受到的阻滯作用小，移動速度快，先出層析柱（此現(xiàn)象叫作被排阻。被排阻的最小分子量稱為該規(guī)格凝膠的排阻極限）；顆粒小于網(wǎng)眼的分子可滲入凝膠網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時不斷地從一個網(wǎng)眼穿到另一個網(wǎng)眼，逐層擴散，阻滯作用大，流程長，移動速度慢，因而后出層析柱。原理···原理原理操作步驟1、層析柱的準備

4、（1）清洗：每組取一支層析柱，用清水沖洗干凈。（2）安裝與檢查：檢查出口裝置中尼龍綢或燒結(jié)濾板是否完好干凈。安裝層析柱，讓其垂直固定于滴定臺架上。對準出口處，放一只250mL燒杯。向?qū)游鲋鶅?nèi)灌洗脫劑，打開出口螺旋夾，檢查有無滲漏、出口乳膠管是否通暢等情況。（3）排氣泡：保持柱內(nèi)一定的水位，用手指彈擊柱壁，部分氣泡會從溶液中上浮排出。出口處的小氣泡易停留在螺旋夾附近的乳膠管內(nèi)，要想法排盡，否則會影響分離結(jié)果，排氣完畢，保留柱內(nèi)1～2cm高水位，關(guān)緊螺旋夾。（4）標記高度：在距頂端8～10cm處做一標記，作為衡量灌裝層析

5、介質(zhì)床體高度（15～17cm）的依據(jù)。操作步驟2、裝柱每組用50mL燒杯取溶脹的凝膠懸漿25～30mL，靜置片刻，觀察凝膠沉淀與水的體積之比，約為1:1即可，否則應(yīng)作調(diào)整。輕輕攪勻杯中凝膠，用玻璃棒引流入柱，打開出水口，并不斷地向柱內(nèi)補充凝膠，直到凝膠沉淀高度位于標記上方約2cm為止，凝膠柱內(nèi)若有氣泡和斷層或柱床表面干水和歪斜，都將影響分離效果。必要時，需倒出凝膠，重新裝柱。操作步驟3、平衡取15mL洗脫劑，用滴管沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著緩緩流下，不可沖動膠平面，打開出水口，經(jīng)洗脫液的流動，一方面清洗內(nèi)壁，另一方面使膠床收緊。洗

6、脫平衡完畢，膠床上方保留約4cm高水位，關(guān)閉出水口。此時，膠床高度≥15cm為宜。4、準備收集取6只干凈的刻度試管（除凈試管內(nèi)殘留的水），1～6編號，并在試管2mL處作一標記。操作步驟5、上樣與收集打開出口排水，當(dāng)膠床與上方水層的彎月面相切時，加入0.6mL混合樣液。上樣完畢，開始收集一號管。每管收集洗脫液2mL。當(dāng)樣液進入膠床，其彎月面與膠平面相切時，暫停排液，用滴管將洗脫劑沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)著加入1cm高水位，然后排液，至其彎月面與膠平面相切，再緩緩注入3～5cm高的洗脫劑。6、洗脫不斷向柱內(nèi)加洗脫劑，保持膠床上水位3～

7、5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6號管達2mL。操作步驟7、鑒定另取6只干凈試管，按收集順序?qū)⑾疵撘阂环譃槎?。第一排每管?滴BaCl2，根據(jù)白色沉淀多少，判斷SO42-在各管中的濃度。第二排每管加1mL考馬斯亮藍G-250試劑，根據(jù)藍色情況，判斷蛋白質(zhì)在各管中的濃度。將結(jié)果記錄于下表中。若鑒定的第6號管中，仍有樣品，表明洗脫和收集不夠，需增加7號、8號……操作步驟管號項目1234567891011白色沉淀量+++藍色深淺+++8、再生鑒定完畢，打開出水口，繼續(xù)用２～３倍床體積洗脫劑洗脫，洗脫后關(guān)閉出口，以

8、備下次使用。1、根據(jù)實驗結(jié)果，在同一坐標系中，以收集的管號為橫坐標，檢測物質(zhì)的量為縱坐標，繪制二條（蛋白質(zhì)及（NH4）2SO4）洗脫曲線。2、分析混合樣品分離效果。結(jié)果處理檢查膠平面是否水平；加樣品及洗脫液時勿沖到膠平面；控制流速；注意事項思考題半透膜透析超濾離子交換色譜等蛋白質(zhì)脫鹽的方法：思考題1、凝膠的選擇：視分離混合物的組成