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《甘蔗水分脅迫響應(yīng)的δ-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因克隆及分子特征分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、熱帶作物學(xué)報CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPS甘蔗水分脅迫響應(yīng)的6-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因克隆及分子特征分析張積森収，陳由強很，郭春芳2,李偉2,闕友雄2,葉冰瑩1,陳如凱2,張木清2*1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350108;2農(nóng)業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點開放實驗室，福建福州350002摘要通過消減文庫技術(shù)，結(jié)合cl)NA芯片技術(shù)篩選到1個明顯受水分脅迫誘導(dǎo)的EST序列(Ratio值為8.1).比對分析推測其為A0AT基因的片段，進(jìn)而通過RACE結(jié)合PCR技術(shù)獲得該基因全長cDNA序列為1782bp,其中5'
2、端非編碼區(qū)150bp,開放閱讀框為1362bp.3'端非編碼區(qū).為270bp且存在2個終止加A信號AATAA。預(yù)測英編碼的蛋白質(zhì)分子凰為49.5ku,等電點為6.5,為?■個跨膜蛋白。序列比對分析結(jié)果表明，8-OAT基因家族N末端和C末端相對不保守.而主要功能區(qū)均表現(xiàn)保守。基因進(jìn)化分析顯示，單子葉禾本科植物和雙子葉植物鳥氨酸轉(zhuǎn)氨薛編碼基因分別由各自祖先進(jìn)化而來，而微生物的鳥粗酸轉(zhuǎn)鎮(zhèn)酶編碼基因表現(xiàn)岀復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系。熒光實時PCR分析6-OAT在根、莖、葉的表達(dá)，該皋因在莖的表達(dá)較高，其次是葉而后為根，但沒有明顯的組織表達(dá)待并性。本文首次報道甘
3、蔗8-OAT因克隆研究結(jié)果，為該革因的深入研究和應(yīng)用更定一定基礎(chǔ)。關(guān)舗詞甘蔗；水分脅迫；酸轉(zhuǎn)氨冊；熒光實時PCR中圖分類號S566」甘譙是中國垠重要的糖料作物，聲糖占全國食糖總產(chǎn)的90%以上。由于廉糖產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和蔗區(qū)的西移，目前旱植甘蔗面積已占全國種植甘蔗總面積的85%以上。因此，研究甘蔗的抗旱分子生物學(xué),從而通過基因匸程手段培育出適合中國栽種的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)甘戀抗早新品種具有廣闊的應(yīng)用前杲。干早脅迫會促使植物體累積可溶性大分子滲透保護(hù)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿和糖醇叫其中脯氨酸是分布最廣的滲透列。近年冇關(guān)脯氨酸代謝的研究表明，脯氨酸具有多種功
4、能，如作為一種可直接利用的能源，或者氮源和碳源RT；其代謝中間產(chǎn)物具冇誘導(dǎo)基因表達(dá)以及降低滲透脅迫所造成的氣傷害作用〔X；鹽脅迫條件下，脯氨酸具有保護(hù)植物根部線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體II免受傷害的功能叫也有研究者指岀脯氨酸代謝是溝通C/N代謝和滲透脅迫的橋梁叫脯氨酸的生物合成途空冇2種，即谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑moi,其中6-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨(S^(omithine-8-aminotransferase,8-OAT；EC2.6.1」3)是鳥氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酸，對脯氨酸合成起苕重要的作用曲12
5、。甘蔗中，尚未有對§一鳥氨酸轉(zhuǎn)氨陸基因進(jìn)行分子生物學(xué)研
6、究的報道。筆者通過tDNA微陣列分析水分脅迫的甘蔗獲得「鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列同源的EST序列，在此基礎(chǔ)上，用RACE技術(shù)克隆甘蔗6-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因的全氏，并對該基因在甘蔗部分組織部位的表達(dá)進(jìn)行.分析，以期為甘蔗抗旱基因工程提供候選基因和理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料供試甘蔗胡種為福農(nóng)95-1702,由福建農(nóng)林大學(xué)甘聲研究所提供，甘蔗長至6?7片真葉時，取根、莖和葉用于RNA提取?；鹳Y助：國家自然科學(xué)星金(No.30370901),國家863計劃“高畫能能源甘曲新骷種的創(chuàng)制與應(yīng)用”(No.2OO7AA100701),國家農(nóng)業(yè)公益性行
7、業(yè)科研專項(No.nyh>-zx07-019)資助，作者簡介：張積森.1977年生.男.博士.研究方向:植物分子生物學(xué).E-mail:zjisen@fjnu.edu.cnn?通訊作者：張木清?1966年生.男.博士.教授.主宴研究方向：作物牛理遺傳與分子徉種，E-maii:zmuqing@163.crom0收稿日期：2009-06-15修回日期：2009-07-021.2方法1.2.1RNA提取甘蔗葉片總RNA的提取參照Invitrogen的TRIZOL試劑盒說明書操作，取700ng,用1%瓊脂糖變性膠進(jìn)行電泳檢測。1.2.2基因芯片第選水
8、分脅迫響應(yīng)的ESTs以Cy5標(biāo)記正常供水的甘蔗mRNA(對照)，Cy3標(biāo)記25%PEG-8000脅迫24h的tt麻mRNA(處理)，與項目組應(yīng)用干早消減文庫制備的cDNA芯片雜交叫雜交分析過程同項目組已發(fā)表論文網(wǎng)。1.2.3RACE和全長cDNA克隆根據(jù)芯片分析中上調(diào)表達(dá)目的基因EST序列(ACCESSION:FK700738),用PrimerPremier5.0設(shè)計基因的3'端擴增引物3'GSP:CCAGATGGCTATTTGAAAGGTG；參照SMARTSRACEcDNAAmplificationKit說明書，以25%PEG-8000脅
9、迫處理24h的甘蔗葉片提取總RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,用于3’RACE擴增。采用降落PCR(TouchDownPCR)進(jìn)行擴增，PCR反應(yīng)條件為：94X：30s,66乞
