歐鰻嗜水氣單胞菌病的研究

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1、歐鰻嗜水氣單胞菌病的研究近年來，歐鰻的大規(guī)模集約化養(yǎng)殖已在我國H益增多。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度的不斷提高，各種影響歐鰻成活率的問題也日漸增多，而由嗜水氣單胞菌作為病原的歐鰻暴發(fā)性傳染病則是其屮一個(gè)突出問題。木文對(duì)嗜水氣單胞菌的生理生化特性、致病因子、致病條件等作了一系列的初步研究，旨在為歐鰻暴發(fā)性傳染病的防治提供冇力的理論依據(jù)，更好地推動(dòng)歐鰻養(yǎng)殖業(yè)向著更強(qiáng)、更快、更健康的方向發(fā)展。一、材料與方法1.病原菌的分離采用普通蛋白瓊脂培養(yǎng)基，其成份為胰蛋白腺10g,酵母膏10g,氯化鈉5g,瓊脂18?20g,pH7.2?7.4,15磅20分鐘滅菌備用。取患典型病癥的鰻魚，以無菌解剖刀將潰

2、爛表層切開，以接種環(huán)迅速挑取少許病灶深層粘液，進(jìn)行瓊脂平板劃線分離。28°C,24小時(shí)常規(guī)培養(yǎng)后，岀現(xiàn)一-些形態(tài)基本一致的菌落。挑取單菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接斜面?zhèn)溆谩?.致病性實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)菌種接斜面，28°C培養(yǎng)約24小時(shí)，每個(gè)斜面中加入無菌生理鹽水5?10mL,制成濃厚菌懸液。取1譏菌懸液，以活菌平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)，吸取O.lniL菌懸液，注入健康鰻鯽腹腔屮（注射前已置水族箱屮觀察5天），同時(shí)設(shè)對(duì)照，置24?28°C水族箱中觀察其癥狀。3.病原菌的形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)采用致病力較強(qiáng)的菌株Ah3、Ah26、Ah38在28°C條件下，經(jīng)24小吋培養(yǎng)，進(jìn)行革蘭氏染色，鞭毛染色，觀察其形態(tài)及

3、其它生理生化實(shí)驗(yàn)。4.血清型研究1）采用小白兔（從市場(chǎng)上購買）制備抗血清。攻毒用健康鰻魚（由養(yǎng)鰻場(chǎng)捉供）,規(guī)格為40?50g左右，試驗(yàn)前觀察5?7天證實(shí)健康無病。2）將具有強(qiáng)致病力的Ah3、Ah26、Ah38等菌株分別于營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)，刮取菌苔，用無菌生理鹽水沖洗菌體三次，將菌體分別用0.35%福爾馬林滅活25小時(shí)，制得全菌抗原（WC抗原），4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?）以0.35%福爾馬林滅活體0.ImL（濃度為1X10E9cel1/mL）加等量弗氏完全佐劑混合均勻，皮下多點(diǎn)免疫口兔，以后每隔一周耳靜脈加強(qiáng)免疫，并逐次加大抗原劑量，獲滿意效價(jià)后頸動(dòng)脈放血取血清。4）試管凝聚法：免抗血清（

4、1:60）稀釋0.25mL,加入0.25mL濃度為15R/mL抗原，充分搖勻，4°C,12小時(shí)，觀察其凝聚反應(yīng)。5?嗜水氣單胞菌毒力（LD50）測(cè)定Ah菌株接種營養(yǎng)肉湯，28°C培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)菌濃度，用無菌生理鹽水10倍系列稀釋菌體，腹腔注射健康鰻鯽，實(shí)驗(yàn)水溫25°C,記錄死魚數(shù)及注射菌量，按Reed—Muench法計(jì)算LD50。6.溶血活力測(cè)定將Ah菌株純分離物接種丁?10%兔血平板，28°C培養(yǎng)過夜，以溶血圈直徑與菌落Z比示溶血活力。6.致病條件的探索性測(cè)定采用致病力較強(qiáng)的Ah38號(hào)菌株為攻毒菌株，調(diào)整水族箱內(nèi)水休環(huán)境，使其含菌量大約為5?104cells/niL,在不同條件下，使健康

5、鰻鯽浸浴其中，以觀察嗜水氣單胞菌的條件致病性。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1?本實(shí)驗(yàn)共分離出菌株63株，其屮經(jīng)人工感染具冇致病力的菌株冇8株，在這8株菌中，乂有3株菌的致病力是極強(qiáng)的。2.病原菌的形態(tài)觀察及生理生化特性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,我們從病魚中就分離到的Ah3、Ah6、Ah7、An26、Ah31、Ah38、Ah5kAh53等菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特性及生理生化反應(yīng)基本一?致，現(xiàn)以Ah38號(hào)菌株為代表簡(jiǎn)述如門在營養(yǎng)瓊脂平板上，28°C,18?24小時(shí)培養(yǎng)菌落圓形、濕潤、表而光滑、低凸，邊緣整齊，半透明，乳口色，直徑1?l?5nm)左右，有異味。在肉湯培養(yǎng)基中，28°C,18?24小時(shí)培養(yǎng)液均勻混濁，表面呈霧狀薄

6、膜，一搖即散，在高倍顯微鏡下，呈兩端圓形的直桿菌，單個(gè)或成對(duì)，能運(yùn)動(dòng)，無芽胞，無莢膜，革蘭氏逖角陰件?出錯(cuò)觀率白單牛帥豐C示據(jù)這些培養(yǎng)特性「我和確認(rèn)所分離到的菌株屬于嗜水氣單胞菌(Aeromonushydrophila),它們是引發(fā)歐洲鰻暴發(fā)性傳染病的主要病原，這一點(diǎn)已得到了大多數(shù)學(xué)者的一致公認(rèn)。3?我們以致病力實(shí)驗(yàn)中致病能力較強(qiáng)的Ah3、Ah26、Ah38號(hào)菌株制備兔抗血清，并與其它5株Ah菌株進(jìn)行了試管凝聚試驗(yàn)，結(jié)果表明，Ah3與Ah38屈同一血?清型，Ah26屈另一血清型，其余5株分屈這兩個(gè)血清型，反應(yīng)專一性強(qiáng)，沒有發(fā)現(xiàn)能同時(shí)與兩種血清型反應(yīng)的菌株。4.嗜水氣單-胞菌毒力(LD50)測(cè)

7、定實(shí)驗(yàn)結(jié)果向我們表明，八株Ah菌株對(duì)健康鰻鯽均有強(qiáng)的毒力，最強(qiáng)的Ah38號(hào)菌株，其LD50低于104CFU,同時(shí)■，毒力強(qiáng)的菌株具菌溶血圈直徑與菌落直徑之比大于2,表明它有較強(qiáng)的溶血活力，其它LD50較低的菌株其溶血活力也較低。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)杲啟示我們，嗜水氣單胞菌的毒力與其溶血活力冇著一定的線性關(guān)系，不同血清型的菌株其溶血能力不一致，在我們的實(shí)驗(yàn)屮，以Ah38號(hào)菌株所代表的血清型有著更強(qiáng)的致病力，這為我們今后尋