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1、酶的定向進化酶進化的概念體外隨機突變的方法基因文庫的建立篩選方法定向進化的概念利用基因工程手段對酶的蛋白質(zhì)分子進行改造，以期獲得性質(zhì)和功能更加完善的蛋白質(zhì)分子。這一技術(shù)領(lǐng)域也被稱為蛋白質(zhì)工程理性設(shè)計：一般僅適用于對那些基因結(jié)構(gòu)及表達的蛋白產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)和功能等方面的信息了解得較為透徹的前提下才采取的方法。非理性設(shè)計：不需要了解蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)和機制，而是通過模擬自然進化（隨即突變、重組和自然選擇），以改進的誘變技術(shù)結(jié)合確定進化方向的選擇方法。體外定向進化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化
2、的基本先決條件。所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。定向進化的原理在待進化酶基因的PCR擴增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對功能的性質(zhì)，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+選
3、擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進化而排除其他方向突變的作用，整個進化過程完全是在人為控制下進行的酶定向進化的基本過程酶基因隨機突變構(gòu)建突變基因文庫負突變基因篩選正突變基因進化酶反復(fù)進行體外隨機突變技術(shù)：易錯PCR技術(shù)DNA重排技術(shù)基因家族重排技術(shù)定向選擇篩選方法：平板篩選法熒光篩選法噬菌體表面展示法細胞表面展示法易錯PCR技術(shù)定義：在體外擴增基因時使用適當條件，使擴增的基因出現(xiàn)少量的堿基誤配，引起突變。通過改變反應(yīng)體系中鎂離子和dNTP的濃度從而引發(fā)突變，提高點突變率遺傳變化只發(fā)生在單一分
4、子內(nèi)部，屬于無性進化易錯PCR的不同點鎂離子濃度較高穩(wěn)定非互補的堿基對添加一定濃度的錳離子降低聚合酶對模板的特異性四種底物的濃度配比改變增加錯配率DNA改組技術(shù)定義：又稱有性PCR，它依賴PCR，是基因在分子水平上進行有性重組，通過改變單個基因原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能。本質(zhì)：從兩種以上同源正突變基因出發(fā)，用酶切割成隨機片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程DNA改組技術(shù)的基本過程兩種以上同源正突變基因DNA隨機片段突變基因構(gòu)建突變基因文庫篩選負突變基因正突變基因進化酶
5、酶切無引物PCR基因重組反復(fù)酶切DNA改組技術(shù)的意義2種以上同源基因中的正突變結(jié)合在一起，通過DNA堿基序列的重新排布，形成新的基因突變，屬于有性進化。本技術(shù)將親本中已有的正突變基因結(jié)合在一起，減少負突變，累積正突變，是加速酶分子進化的有效手段重組同時伴隨著點突變的產(chǎn)生基因文庫的構(gòu)建構(gòu)建基因文庫的質(zhì)量要求構(gòu)建文庫的主要過程構(gòu)建基因文庫的質(zhì)量要求文庫的包容性：盡可能的包含基因的任何一種可能的突變信息（正突變、負突變和中性突變）文庫的完整性：ＤＮＡ片段必須盡可能完整地反映基因的結(jié)構(gòu)和功能信息。建庫的主要過程載體的選擇基因重組：在體外，將基因與載體
6、ＤＮＡ連接在一起形成重組ＤＮＡ的技術(shù)過程組裝突變基因文庫：將重組ＤＮＡ轉(zhuǎn)入受體細胞或包裝成有感染活性的重組噬菌體的過程切接轉(zhuǎn)增檢酶突變基因的定向選擇突變基因基因載體突變基因文庫篩選目的基因高通量篩選技術(shù)平板篩選法熒光篩選法噬菌體篩選法細胞表面展示法核糖體表面展示法平板篩選法依據(jù)細胞生長情況篩選突變基因１以提高酶的熱穩(wěn)定性為目標的定向進化２以提高抗生素耐受性的定向進化３以提高酶的ｐＨ穩(wěn)定性為目標的篩選依據(jù)顏色變化篩選突變基因１ＬａｃＺ基因編碼半乳糖苷酶和Ｘ－ｇａｌ反應(yīng)會形成藍色菌落２在平板中加入硝基酚磷酸（NPP），重組細胞產(chǎn)生磷酸酯酶，會使細
7、胞周圍產(chǎn)生黃色，黃色的深淺可以反應(yīng)酶的活性的高低依據(jù)透明圈情況篩選突變基因定向進化的選擇策略1、定向進化中，突變具有隨機性，但通過選擇特定方向的突變限定了進化趨勢，加之控制實驗條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。2、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。3、高通量的篩選體系定向進化的應(yīng)用一．提高酶分子的催化活力二．提高酶分子的穩(wěn)定性三．提高底物的專一性和增加對新底物．催化活力的進化
8、四．對映體選擇性的定向進化五．變換催化反應(yīng)專一性
