單克隆抗體與基因工程抗體的制備分解ppt課件.ppt

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1、單克隆抗體與基因工程抗體的制備抗體種類(lèi)：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)雜交瘤技術(shù)的基本原理單克隆抗體的制備一、單克隆抗體的產(chǎn)生二、單克隆抗體的純化三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性基因工程抗體制備一、基因工程抗體種類(lèi)二、原理三、重組抗原制備過(guò)程基本概念抗原決定簇（抗原表位）細(xì)胞克隆多克隆抗體單克隆抗體是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位(epitope).由一個(gè)B淋巴細(xì)胞增殖而

2、成的細(xì)胞集團(tuán)針對(duì)多種抗原決定簇的混合抗體由單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的同源抗體雜交瘤技術(shù)的理論基礎(chǔ)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō)，即一種克隆只產(chǎn)生一種抗體細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞，并克隆化，制備McAb當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞緊密接觸時(shí)，細(xì)胞膜可能融合在一起。融合細(xì)胞含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核，稱為異核體，產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybridcell）。雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)?胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)

3、：反復(fù)的免疫學(xué)檢測(cè)篩選克隆化增殖的雜交瘤?細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤?細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體流程雜交瘤技術(shù)不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞動(dòng)物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）免疫脾細(xì)胞細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強(qiáng)免疫免疫小鼠細(xì)胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞

4、膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3-10)50%PEG1min內(nèi)加完;10ml培養(yǎng)液終止反應(yīng)融合方法SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：2～51ml50%的PEG（無(wú)菌，預(yù)溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置45秒,時(shí)間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個(gè)。融合后7-14天，換用HT培養(yǎng)液細(xì)胞融合7～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細(xì)胞的早期培養(yǎng)HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxan

5、thine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNA雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)HAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻雜交瘤細(xì)胞：長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法方

6、法：細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋每個(gè)培養(yǎng)孔含0.5～1個(gè)細(xì)胞陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存單克隆抗體的制備經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克隆抗體。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只體外培養(yǎng)法：中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)單抗含量不高，牛血清Ab難以去除腹腔注射法鹽析沉淀親和層析離子交換層析二、McAb的純化Ig類(lèi)型、亞類(lèi)測(cè)定：雙擴(kuò)法或ELISA法特異性測(cè)定：抗原類(lèi)似物的

7、交叉反應(yīng)效價(jià)測(cè)定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示表位測(cè)定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競(jìng)?爭(zhēng)抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分析親和性測(cè)定：測(cè)定親和常數(shù)K雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤細(xì)胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblot三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定四、單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復(fù)性弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)對(duì)環(huán)境敏感性（一）單克隆抗體的特性優(yōu)點(diǎn)：在體外“永久”地存活并傳代用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方