hiv-1 p24抗原檢測方法研究進(jìn)展

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1、HIV-1P24抗原檢測方法研究進(jìn)展關(guān)鍵詞：HIV-1P24抗原；酶免疫測定法；檢測方法今年是世界艾滋病流行以來的第33個(gè)年頭,全球艾滋病流行與防治形勢(shì)都發(fā)生了巨大的變化。自上世紀(jì)九十年代中期高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART）技術(shù)應(yīng)用以來,成千上萬的艾滋病病人得到有效治療。然而，由于HIV本身的高變異率，導(dǎo)致臨床上尚無有效的根除HIV的治療方法。因此，對(duì)艾滋病的防控手段仍以預(yù)防為主。目前，對(duì)HIV感染的檢測方法包括抗體檢測、P24抗原檢測、核酸檢測以及CD4+T淋巴細(xì)胞水平檢

2、測等。由于從感染HIV到出現(xiàn)可檢測的抗體尚有一段時(shí)間，因此雖然抗-HIV檢測的ELISA試劑經(jīng)歷了4代發(fā)展[1]，但其“窗口期”問題仍不可避免；而可以進(jìn)一步縮短“窗口期”問題的核酸檢測和CD4+T淋巴細(xì)胞水平檢測，由于其檢測過程較復(fù)雜、耗時(shí)較長且需要特殊儀器而不易普及。HIV-1侵入人體后，核心抗原P24的水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，并在急性感染期即可出現(xiàn)，通常被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志，與病情發(fā)展密切相關(guān)。因此，血液及其他體液標(biāo)本中P24抗原的檢測可以縮短窗口期，有助于HIV-1的早期診斷、預(yù)后判斷及評(píng)價(jià)抗病毒治療的效果，具有良好的實(shí)際

3、應(yīng)用價(jià)值。1P24抗原的生物學(xué)特性HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類慢病毒組，為直徑約100-120nm的球形顆粒，由核心和包膜兩部分組成。核心包括兩條單股RNA鏈、核心結(jié)構(gòu)蛋白和病毒復(fù)制所必須的酶類，包括逆轉(zhuǎn)錄酶（RT,P51/P66），整合酶（INT,P32）和蛋白酶（PI，P10）.核心外面為病毒衣殼蛋白（P24，P17）.病毒的最外層為包膜，其中嵌有g(shù)p120(外膜糖蛋白)和gp41(跨膜糖蛋白)兩種糖蛋白。HIV基因全長約9.8kbp,含有3個(gè)結(jié)構(gòu)基因（gag,pol和env）、2個(gè)調(diào)節(jié)基因（tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表達(dá)調(diào)

4、節(jié)因子）和4個(gè)輔助基因（nef負(fù)調(diào)控因子、vpr病毒r蛋白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子）。HIV變異性很強(qiáng)，各基因的變異程度各不同。其中以env基因的變異率最高，gag和pol基因相對(duì)保守。Gag基因編碼55kd的前體蛋白，在pol基因編碼的蛋白酶的加工下產(chǎn)生P17、P24和P55蛋白，因此P24蛋白氨基酸順序高度保守，這使其在HIV-1感染的檢測中顯示良好的規(guī)律性。2P24抗原的檢測方法2.1ELISA檢測P24抗原目前，商品化的P24抗原檢測試劑盒都是依據(jù)夾心Elisa。首先以P24單克隆抗體包被微孔板，加人待檢標(biāo)本孵育，待檢標(biāo)本

5、中若存在P24抗原，則被“捕捉”結(jié)合于包被抗體，然后依次加入生物素化的抗．HIV多克隆抗體、鏈親合素化的辣根過氧化物酶和反應(yīng)底物顯色，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD值判斷結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)P24抗原檢測方法的陽性檢出率相對(duì)較低，在無癥狀攜帶者中通常僅為8％一10％，在艾滋病相關(guān)綜合征(AIDS-relatedcomplex，ARC)患者中為12％，在AIDS患者中為37％一86％。這種低檢出率可能與感染早期P24核心抗原量較少，以及在病情發(fā)展階段P24抗原與抗體形成抗原抗體復(fù)合物阻礙了抗原的檢測有關(guān)。改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的方法或設(shè)計(jì)新方法，可以增強(qiáng)檢測的敏感性，提高陽

6、性檢出率。目前開發(fā)的第4代H1V診斷試劑就是在第3代試劑的基礎(chǔ)上，加入了HIV-1P24抗原檢測系統(tǒng)，可同時(shí)檢測血清／血漿中的HIV-1抗體和P24抗原，使診斷窗口期與第3代ELISA檢測試劑相比，平均縮短了4d，使艾滋病早期診斷的效果明顯優(yōu)于第3代。既便如此，第4代試劑仍然有2-3周的診斷窗口期。此外，由于抗原和抗體同時(shí)包被在反應(yīng)板上，存在著相互干擾的可能，影響了免疫反應(yīng)的特異性，再加之第2窗口期的存在，影響了檢測的敏感性。因此通常來講，使用第4代試劑檢測P24抗原，其靈敏度[(20-l00)pg/m1]遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單獨(dú)檢測抗原抗體分析法[(3.5

7、-10)pg/m1]。從方法學(xué)上來講，這種基于ELISA的分析方法，靈敏度終歸是有限的，相對(duì)化學(xué)發(fā)光和時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)等更為先進(jìn)的分析方法，其靈敏度仍較低[2-5]。2.2P24抗原檢測的新方法由于ELISA本身的局限性以及P24抗原檢測在HIV-1診斷中的重要作用，近幾年來國內(nèi)外對(duì)建立高靈敏度檢測P24抗原的研究一直就未曾停止過。先后研發(fā)了免疫復(fù)合物解離P24抗原測定法(immune-complexdisassociate，ICD)，信號(hào)放大增強(qiáng)ELISA(signal-amplification-boostedELISA)，超敏感酶免

8、測定法(ultrasensitiveenzymeimmunoassay，UEI)，免疫吸附電鏡法(immunosorbente1ectr