生物藥物分析與檢驗基因工程藥物檢驗ppt課件.ppt

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1、第十一章基因工程藥物檢驗基因工程藥物與一般藥物比較：①它是利用活的細胞作為表達系統(tǒng)，所獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對分子質(zhì)量較大，并具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；②許多基因工程藥物是參與人體一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，極微量就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)。③宿主細胞中表達的外源基因，在轉(zhuǎn)錄或翻譯、工藝放大等過程中，都有可能發(fā)生變化。一、基因工程藥物質(zhì)量要求(1)要求提供關(guān)于表達體系的詳細資料，以及工程菌(或工程細胞)的特征、純度(是否污染外來因子)和遺傳穩(wěn)定性等資料。(2)提供培養(yǎng)方法和產(chǎn)量穩(wěn)定性、純化方法以及各步中間產(chǎn)品的收率和純度、

2、除去微量的外來抗原、核酸、病毒或微生物等方法。(3)要求進行理化鑒定，包括產(chǎn)品的特征、純度及與天然產(chǎn)品的一致性。一般純度應(yīng)在95%以上。(4)要求進行外源核酸和抗原檢測，規(guī)定每劑量DNA含量不超過l00pg，細胞培養(yǎng)產(chǎn)品中小牛血清含量須合格。成品中不應(yīng)含有純化過程中使用的試劑，包括層析柱試劑和親和層析用的鼠IgG。(5)生物活性或效力試驗結(jié)果應(yīng)與天然產(chǎn)品進行比較。(6)基因工程產(chǎn)品的理化和生物學(xué)性質(zhì)與天然產(chǎn)品完全相同者一般不需重復(fù)所有動物毒性試驗，與天然產(chǎn)品略有不同者需做較多試驗，與天然產(chǎn)品有很大不同者則須做

3、更多試驗，包括致癌、致畸和對生育力的影響等。(7)所有基因工程產(chǎn)品都必須經(jīng)過臨床試驗，以評價其安全性和有效性。二、基因工程藥物的質(zhì)控要點(一)原材料的控制(二)生產(chǎn)的控制(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制※1、表達載體和宿主細胞應(yīng)提供有關(guān)表達載體詳細資料，包括基因的來源、克隆和鑒定、表達載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。(一)原材料的控制2、克隆基因的序列應(yīng)提供插入基因和表達載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達有關(guān)的序列均應(yīng)詳細敘述。3.表達應(yīng)詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動和控制克隆基因在宿主細胞中的表達所采用的方法及表達水

4、平。(二)生產(chǎn)的控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。1、原始細胞庫應(yīng)詳細記述種子材料的來源、方式、保存及預(yù)計使用壽命；應(yīng)提供在保存和復(fù)蘇條件下宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)；采用新的種子批時，應(yīng)重新作全面檢定。2、有限代次的生產(chǎn)提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性的數(shù)據(jù)；依據(jù)宿主細胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)和細胞倍增數(shù)，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細資料。3、連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)應(yīng)提供經(jīng)長期培養(yǎng)后所

5、表達基因的分子完整性資料，以及宿主細胞的表型和基因型特征。4、純化對于收獲、分離和純化的方法應(yīng)詳細記述，應(yīng)特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除。對整個純化工藝應(yīng)進行全面研究，包括能夠去除宿主細胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗方法。(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制1.產(chǎn)品的鑒定①電泳方法②免疫學(xué)分析方法③受體結(jié)合試驗④高效液相色譜法⑤肽圖分析法⑥EdmanN末端序列分析法⑦圓二色譜法⑧核磁共振法

6、(1)氨基酸成分分析氨基酸成分分析可為目的產(chǎn)物的純度檢定提供信息。完整的氨基酸成份分析結(jié)果，應(yīng)包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的準確值。氨基酸成份分析結(jié)果應(yīng)為三次分別水解樣品測定后的平均值。(2)肽圖分析肽圖分析（PeptideMapping）：肽圖分析是根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶作用于特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜。肽圖分析可作為與天然產(chǎn)品或參考品作精密比較的手段。與氨基酸成分和序列分析結(jié)果合并，可作為蛋白質(zhì)的精確鑒別

7、。(3)重組蛋白質(zhì)的濃度測定和相對分子質(zhì)量測定蛋白質(zhì)濃度測定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外光譜法等。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定最常用的方法有凝膠過濾法和SDS-PAGE法。(4)蛋白質(zhì)二硫鍵分析測定方法有:對氯汞苯甲酸法等5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法2、純度分析(1)目的蛋白質(zhì)含量測定(2)產(chǎn)物雜質(zhì)檢測(1)目的蛋白質(zhì)含量測定測定蛋白質(zhì)含量的方法可根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來設(shè)計。①聚丙烯酰胺凝膠電泳②高效液相色譜(2)產(chǎn)物雜質(zhì)檢測基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和

8、非蛋白質(zhì)兩類。蛋白類雜質(zhì)：殘留宿主細胞蛋白采用免疫分析的方法非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)：①病毒污染檢查②無菌試驗③熱原質(zhì)試驗④殘余細胞DNA測定。⑤抗原性物質(zhì)檢查⑥其他外源性物質(zhì)常用檢測方法：雜質(zhì)和污染物檢測方法內(nèi)毒素鱟試劑、家兔熱原法宿主細胞蛋白免疫分析、SDS-PAGE、CE其它蛋白雜質(zhì)免疫分析、SDS-PAGE、HPLC、CE殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE3.