生物藥物分析與檢驗(yàn)基因工程藥物檢驗(yàn)ppt課件.ppt

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1、第十一章基因工程藥物檢驗(yàn)基因工程藥物與一般藥物比較：①它是利用活的細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，所獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對分子質(zhì)量較大，并具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；②許多基因工程藥物是參與人體一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，極微量就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)。③宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄或翻譯、工藝放大等過程中，都有可能發(fā)生變化。一、基因工程藥物質(zhì)量要求(1)要求提供關(guān)于表達(dá)體系的詳細(xì)資料，以及工程菌(或工程細(xì)胞)的特征、純度(是否污染外來因子)和遺傳穩(wěn)定性等資料。(2)提供培養(yǎng)方法和產(chǎn)量穩(wěn)定性、純化方法以及各步中間產(chǎn)品的收率和純度、

2、除去微量的外來抗原、核酸、病毒或微生物等方法。(3)要求進(jìn)行理化鑒定，包括產(chǎn)品的特征、純度及與天然產(chǎn)品的一致性。一般純度應(yīng)在95%以上。(4)要求進(jìn)行外源核酸和抗原檢測，規(guī)定每劑量DNA含量不超過l00pg，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品中小牛血清含量須合格。成品中不應(yīng)含有純化過程中使用的試劑，包括層析柱試劑和親和層析用的鼠IgG。(5)生物活性或效力試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)與天然產(chǎn)品進(jìn)行比較。(6)基因工程產(chǎn)品的理化和生物學(xué)性質(zhì)與天然產(chǎn)品完全相同者一般不需重復(fù)所有動(dòng)物毒性試驗(yàn)，與天然產(chǎn)品略有不同者需做較多試驗(yàn)，與天然產(chǎn)品有很大不同者則須做

3、更多試驗(yàn)，包括致癌、致畸和對生育力的影響等。(7)所有基因工程產(chǎn)品都必須經(jīng)過臨床試驗(yàn)，以評價(jià)其安全性和有效性。二、基因工程藥物的質(zhì)控要點(diǎn)(一)原材料的控制(二)生產(chǎn)的控制(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制※1、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料，包括基因的來源、克隆和鑒定、表達(dá)載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。(一)原材料的控制2、克隆基因的序列應(yīng)提供插入基因和表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達(dá)有關(guān)的序列均應(yīng)詳細(xì)敘述。3.表達(dá)應(yīng)詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動(dòng)和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)所采用的方法及表達(dá)水

4、平。(二)生產(chǎn)的控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。1、原始細(xì)胞庫應(yīng)詳細(xì)記述種子材料的來源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用壽命；應(yīng)提供在保存和復(fù)蘇條件下宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)；采用新的種子批時(shí)，應(yīng)重新作全面檢定。2、有限代次的生產(chǎn)提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性的數(shù)據(jù)；依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)和細(xì)胞倍增數(shù)，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。3、連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)應(yīng)提供經(jīng)長期培養(yǎng)后所

5、表達(dá)基因的分子完整性資料，以及宿主細(xì)胞的表型和基因型特征。4、純化對于收獲、分離和純化的方法應(yīng)詳細(xì)記述，應(yīng)特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除。對整個(gè)純化工藝應(yīng)進(jìn)行全面研究，包括能夠去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗(yàn)方法。(三)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制1.產(chǎn)品的鑒定①電泳方法②免疫學(xué)分析方法③受體結(jié)合試驗(yàn)④高效液相色譜法⑤肽圖分析法⑥EdmanN末端序列分析法⑦圓二色譜法⑧核磁共振法

6、(1)氨基酸成分分析氨基酸成分分析可為目的產(chǎn)物的純度檢定提供信息。完整的氨基酸成份分析結(jié)果，應(yīng)包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的準(zhǔn)確值。氨基酸成份分析結(jié)果應(yīng)為三次分別水解樣品測定后的平均值。(2)肽圖分析肽圖分析（PeptideMapping）：肽圖分析是根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜。肽圖分析可作為與天然產(chǎn)品或參考品作精密比較的手段。與氨基酸成分和序列分析結(jié)果合并，可作為蛋白質(zhì)的精確鑒別

7、。(3)重組蛋白質(zhì)的濃度測定和相對分子質(zhì)量測定蛋白質(zhì)濃度測定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林-酚法和紫外光譜法等。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量測定最常用的方法有凝膠過濾法和SDS-PAGE法。(4)蛋白質(zhì)二硫鍵分析測定方法有:對氯汞苯甲酸法等5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法2、純度分析(1)目的蛋白質(zhì)含量測定(2)產(chǎn)物雜質(zhì)檢測(1)目的蛋白質(zhì)含量測定測定蛋白質(zhì)含量的方法可根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來設(shè)計(jì)。①聚丙烯酰胺凝膠電泳②高效液相色譜(2)產(chǎn)物雜質(zhì)檢測基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和

8、非蛋白質(zhì)兩類。蛋白類雜質(zhì)：殘留宿主細(xì)胞蛋白采用免疫分析的方法非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)：①病毒污染檢查②無菌試驗(yàn)③熱原質(zhì)試驗(yàn)④殘余細(xì)胞DNA測定。⑤抗原性物質(zhì)檢查⑥其他外源性物質(zhì)常用檢測方法：雜質(zhì)和污染物檢測方法內(nèi)毒素鱟試劑、家兔熱原法宿主細(xì)胞蛋白免疫分析、SDS-PAGE、CE其它蛋白雜質(zhì)免疫分析、SDS-PAGE、HPLC、CE殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE3.