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1、Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTU實驗六細(xì)菌生長曲線之測定◎Exp11.Turbidityofbacteria一、目的：在進(jìn)行細(xì)菌生長曲線之測定前，必須先了解U-2001Spectropho-tometer操作方法，才能將細(xì)菌的數(shù)量以吸光值的方式表示出來。二、原理：請詳讀整理p.90-92，學(xué)會調(diào)整Opticaldensity(O.D.)【Exp13.會用到】。三、器材：1.culture：(每組)24hrEscherichiacoli(broth)2.medium：(每組)Nutrientbr
2、oth3.equipment：1mlpipette，pipetteaid，cuvette，拭鏡紙，廢菌液杯，裝蒸餾水的洗瓶，滅菌空試管，U-2001Spectrophotometer，振盪器。四、實驗步驟※由助教先示範(fàn)操作方法，再由學(xué)生自行操作與測量待測液之吸光值。1.了解U-2001Spectrophotometer操作方法：a.溫機(jī)約15分鐘。b.MENU→(主目錄)選1.Photometer→輸入波長600nm及ABS→Forward→c.Nutrientbroth歸零autozero→(前、後二支cuvette)※1d.取出後面之cuv
3、ette，倒入待測液※2，等到右上方數(shù)據(jù)穩(wěn)定後，按下Start→記錄?！?cuvette有石英管(測波長340nm以下)、玻璃管、塑膠管等材質(zhì)，本實驗使用塑膠材質(zhì)之比色管?！?每次測定前需先用蒸餾水滴洗cuvette，再以待測液潤濕，倒掉，再裝入待測液，測完倒掉，用蒸餾水滴洗。測定之前33Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTUcuvette須用拭鏡紙擦乾，手握管的非透明處；廢菌液請滴洗入廢菌液杯中，集中處理)。2.每組取一管助教所準(zhǔn)備之E.coli當(dāng)待測液，實際演練U-2001Spectrophot
4、ometer操作，測出其原液O.D.【Exp13.將會利用到此操作，故須熟悉其操作步驟】?！駿xp12.SerialDilution-AgarPlateProceduretoQuantitateViableCells一、目的：1.學(xué)習(xí)連續(xù)稀釋法。2.觀察活菌數(shù)。二、原理：微生物數(shù)目之計數(shù)法有：1.直接顯微鏡計數(shù)(DirectMicroscopicCounts)：以PetroffHauserchamber計數(shù)。僅計數(shù)微量菌液，再由數(shù)學(xué)方法求取總菌數(shù)，此法迅速方便但活與死菌皆涵蓋之且總菌數(shù)若低於一百萬時，準(zhǔn)確度差。2.電子細(xì)胞計數(shù)器(Electro
5、nicCellCounters)：如CoulterCounter，此法不能區(qū)分活或死菌，也無法區(qū)別惰性顆粒物質(zhì)與細(xì)胞物質(zhì)。3.化學(xué)方法(ChemicalMethods)：以間接測定蛋白質(zhì)濃度、DNA產(chǎn)量、細(xì)胞質(zhì)量及代謝物等反推菌數(shù)。4.分光光度計分析(SpectrophotometricAnalysis)：利用穿透菌液之光線量，隨菌量增加而減少。此法迅速但菌數(shù)若低於一千萬時，敏感度差。5.連續(xù)稀釋-洋菜平板法(SerialDilution-AgarPlate)：此法乃計數(shù)活菌。利用無菌水對菌液做一連串稀釋，採PourPlate法進(jìn)行之，經(jīng)隔夜培
6、養(yǎng)後計數(shù)(或者使用Quebec，參考課本Figure21.4,p.89)。本實驗課中繪製細(xì)菌生長曲線之方法便是利用連續(xù)稀釋-洋菜平板法，故Exp12與細(xì)菌生長曲線之測定一併進(jìn)行。33Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTU◎Exp13.TheBacterialGrowthCurve一、目的：了解細(xì)菌的族群生長變動，繪製生長曲線(growthcurve)，並求出增代時間(generationtime)。二、原理：a.細(xì)胞的生長：將細(xì)菌接種在液態(tài)培養(yǎng)基中，置於其最適環(huán)境下(最適溫度、pH及氣體組成)培養(yǎng)，
7、則可求出一細(xì)菌生長曲線。細(xì)菌之生長曲線可分成以下數(shù)個時期：1.遲滯期(lagphase)：細(xì)胞正在適應(yīng)新環(huán)境，數(shù)目無明顯增加。2.對數(shù)期(logphase)：細(xì)胞生長快速，數(shù)目呈幾何級數(shù)增加。3.靜止期(stationaryphase)：因養(yǎng)分耗盡、代謝廢物的堆積，細(xì)胞分裂與死亡速度相當(dāng)，故其數(shù)目不增加。4.死滅期(deathphase)：細(xì)胞快速死亡，數(shù)目呈幾何級數(shù)下降。b.生長曲線之測量：可用pourplate法，直接求得活細(xì)胞數(shù)目，或是用分光光度計讀值法，間接推測細(xì)胞生長量。之後在半對數(shù)方格紙上作圖。c.generationtime的計算
8、：1.較粗略的計算(分光光度計結(jié)果)：GT＝t(O.D.2n)－t(O.D.n)GT：generationtime2.直接細(xì)胞數(shù)目的計算(pour-p
