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1、微生物實驗實驗日期：2017.11.1實驗班級：生物技術指導教師：張建麗姓名：高熹學號：1120152430測定細菌生長曲線一．實驗目的1.通過對大腸桿菌生長曲線的測定，了解細菌生長的特點，綜合訓練微生物實驗的基本實驗技能。2.鞏固培養(yǎng)基的配制、滅菌、儀器的包扎、倒平板。3.掌握用比濁法測定細菌的生長曲線。二．實驗原理將少量細菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進行培養(yǎng)，一定時間測定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的數(shù)量作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的群體生長
2、規(guī)律。依據(jù)其生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延緩期、生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。將每一種一定量的細菌轉入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細胞要經歷延遲期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。延遲期：又叫調整期。細菌接種至培養(yǎng)基后，對新環(huán)境有一個短暫適應過程（不適應者可因轉種而死亡）。此期曲線平坦穩(wěn)定，因為細菌繁殖極少延遲期長短因素種、接種菌量、菌齡以及營養(yǎng)物質等不同而異，一般為1～4小時。此期中細菌體積增大，代謝活躍，為細菌的分裂增殖合成、儲備充足的酶、能量及中間代謝產物。對數(shù)生長期：又稱指數(shù)期。此期生長曲線上活菌數(shù)直線上升。細菌以穩(wěn)定的
3、幾何級數(shù)極快增長，可持續(xù)幾小時至幾天不等（視培養(yǎng)條件及細菌代時而異）。此期細菌形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對外界環(huán)境因素的作用敏感，因此研究細菌性狀以此期細菌最好。抗生素作用，對該時期的細菌效果最佳。穩(wěn)定期：該期的生長菌群總數(shù)處于平坦階段，但細菌群體活力變化較大細菌濃度達到最大即環(huán)境最大容納量。由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質消耗、毒性產物（有機酸、過氧化物等）積累PH下降等不利因素的影響，細菌繁殖速度漸趨下降，相對細菌死亡數(shù)開始逐漸增加，此期細菌增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡。細菌形態(tài)、染色、生物活性可出現(xiàn)改變，并產生相應的代謝產物如外毒素、內毒素、抗生素、
4、以及芽孢等。衰亡期：隨著穩(wěn)定期發(fā)展，細菌繁殖越來越慢，死亡菌數(shù)明顯增多?；罹鷶?shù)與培養(yǎng)時間呈反比關系，此期細菌變長腫脹或畸形衰變，甚至菌體自溶，難以辯認其形。生理代謝活動趨于停滯。故陳舊培養(yǎng)物上難以鑒別細菌。 體內及自然界細菌的生長繁殖受機體免疫因素和環(huán)境因素的多方面影響，不會出現(xiàn)象培養(yǎng)基中那樣典型的生長曲線。掌握細菌生長規(guī)律，可有目的地研究控制病原菌的生長，發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)對人類有用的細菌。這4個時期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所不同。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解個菌的生長規(guī)律，對于科研和生產都具有重要的指導意義。測定
5、微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實驗室條件選用。本實微生物實驗驗用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，此法快捷、簡單。三．實驗設備及材料準備好的大腸桿菌和枯草桿菌菌液、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、紫外可見分光光度計、比色皿、恒溫搖床、培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、酒精燈、電爐、接種環(huán)、試管架、錐形瓶、無菌吸管、燒杯、乳膠頭、報紙、膠塞、玻璃棒等。四．實驗方法步驟及注意事項實驗步驟:配制營養(yǎng)肉
6、湯培養(yǎng)基→營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基滅菌→配制大腸桿菌菌液標記→接種→培養(yǎng)→測定→繪制生長曲線1.配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:以1000ml記，牛肉膏:3.0g、蛋白胨:10.0g、NaCl:5.0g、水:1000ml、pH:7.4-7.62.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基滅菌:將步驟一包好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌15min.3.接種:用1mL無菌移液管分別移取1mL大腸桿菌菌液和1ml的枯草桿菌菌液至錐形瓶中，并充分震蕩均勻.4.培養(yǎng):將錐形瓶置于37℃下在恒溫搖床上培養(yǎng)（150r/min）。然后分別按對應時間將錐形瓶取出，待培養(yǎng)結束時測定OD值。5.測定:將培
7、養(yǎng)的大腸菌群菌液用無菌移液管移取到比色皿中，選用600nm分光光度計上調節(jié)零點，用蒸餾水作為空白對照，并對不同時間培養(yǎng)液從0起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用自來水適當稀釋后測定，使其OD值大約在0.2-0.8之間，經稀釋后測得的OD值要乘于稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD值。6.繪制生長曲線:對所得數(shù)據(jù)進行生長曲線的繪制，分析實驗結果。五．實驗結果大腸桿菌：時間/min0150250310340370400430460490520550Od（倍數(shù)換算）0.6380.8671.5662.0552.3003.1003.5323.7084.0084
8、.4645.0645.229枯草桿菌：時間/min0150250310340370400430460490520550Od（倍數(shù)換算）0.5610.3990.353
