細胞水平-蛋白水平-基因水平評估T細胞分泌IFN-γ.doc

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1、一、細胞水平ELISPOT原理：本實驗旨在測IFN-γ的分泌情況，T細胞受抗原刺激后分泌IFN-γ，同時被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素標記的二次抗體來標志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細胞會留下約10-20mm大小染色的斑點。方法：（1）獲得PBMC（2）IFN-γ誘導(dǎo)分泌：陽性對照品加入PMA，陰性對照不加刺激物。（3）主要方法：處理PVDF孔板，在活化后預(yù)包被好抗體的平板中分別加入陰性PBMC及陽

2、性PBMC，37℃孵育。第二天洗板后,加緩沖液后，孵育。清洗，加入稀釋的檢測抗體，孵育1小時,洗板后再加入親和素堿性磷酸酶再次孵育。最后加入BCIP/NBT顯色，倒去液體，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，4℃下放置一夜后讀取點數(shù)，計算待測樣本中IFN-γ的含量，從而評估T細胞的功能。細胞內(nèi)細胞因子染色原理：通過體外多克隆激活劑或特定的抗原激活T細胞，同時抑制IFN-γ釋放到細胞外,使之在細胞質(zhì)內(nèi)蓄積，信號增強。增加細胞膜的通透性后，用抗細胞因子的抗體與胞內(nèi)特定的分子相結(jié)合，通過非相關(guān)特異性同型匹配的抗體作為對照

3、，以確定靜止的與無細胞因子分泌的細胞的最小熒光背景，這樣就可以用流式細胞儀檢測不同細胞亞群分泌的細胞因子。方法：取T細胞，用PMA和Ionomycin同時刺激后孵育→→加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)→→細胞表面染色→→固定，破膜→→重懸細胞→→加入熒光標記抗體，避光→→緩沖液重懸，流式細胞儀檢測→→結(jié)果分析二、蛋白水平ELISA原理：本實驗所測T細胞分泌的IFN-γ有多個表位，采用雙抗體夾心法來測含量，IFN-γ與酶結(jié)合后不改變其原有的特異性及免疫反應(yīng)性，同時也不影響酶的催化效能。當(dāng)存在相應(yīng)的酶底物時，酶能催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物

4、，顏色的有無和深淺可以反映IFN-γ的分泌情況。方法：(1)獲得PBMC：將采集的靜脈血置于肝素抗凝試管中,每份分別用等量RPMI1640培養(yǎng)液稀釋，以淋巴細胞分離液分離PBMC。(2)IFN-γ誘導(dǎo)分泌：陽性組每孔加入一定量ＰＨＡ，陰性組不加ＰＨＡ。細胞經(jīng)37℃5%CO2,培養(yǎng)72h，2000rmp高速離心20min,取上清液。(3)主要方法：用一抗包被，放置在反應(yīng)板中4℃過夜。洗滌三次，將已知含量的IFN-γ標準品倍比稀釋于各孔中，并設(shè)置陽性組、陰性對照組、空白對照組。加樣后，孵育，洗滌。每孔加入酶，再次孵育，洗滌。加

5、入底物后顯色，讀取OD值，繪制標準曲線。根據(jù)參考蛋白的含量計算待測樣本中IFN-γ的含量，從而評估T細胞的功能。Westernblot原理：IFN-γ在本質(zhì)上屬于蛋白質(zhì)，因此可以采用Western-Blot進行檢測。經(jīng)過SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持原有的物質(zhì)類型和生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。方法：

6、蛋白質(zhì)樣品獲得→→制膠（1%瓊脂糖封底；裝配電泳槽；灌注分離膠；灌注濃縮膠）→→樣品處理→→電泳→→轉(zhuǎn)移→→免疫學(xué)檢測（封閉過夜；一抗37°C1h洗3次；二抗37°C1h洗3次；底物顯色5-15分鐘；ddH2O洗滌）→→結(jié)果檢測三、基因水平Northernblot原理：采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原為轉(zhuǎn)移至固相支持物（硝酸纖維素膜）上，再用放射性（或非放射性）標記的DNA或RNA探針，依據(jù)其同源性進行雜交，最后進行放射自顯影（或化學(xué)顯影），以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強

7、度則可提示目標RNA在所測樣品中的相對含量（即目標RNA的豐度）雖然Northern也可檢測目標mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測目的基因在組織細胞中有無表達及表達的水平如何。方法：總RNA提取→→變性膠的制備→→樣品制備→→電泳→→將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上→→轉(zhuǎn)移完畢后，凝膠置紫外燈下，觀察是否有殘留RNA→→膜烤干保存→→探針的制備→→探針的純化及比活性測定→→預(yù)雜交→→探針標記→→雜交→→洗膜→→壓片暗盒中自顯影→→去除膜上的探針RT-PCR原理：將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（P

8、CR）相結(jié)合的技術(shù)。對T細胞的總RNA進行抽提，以其中的mRNA作為模板，在Oligo（dT）逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后設(shè)計IFN-γ基因引物進行PCR，通過分析電泳條帶灰度值，得出IFN-γ基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對量的變化，從而檢測T細胞中IFN-γ表達水平。方法：T細胞總RNA