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《細(xì)胞水平-蛋白水平-基因水平評估T細(xì)胞分泌IFN-γ.doc》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、一、細(xì)胞水平ELISPOT原理:本實(shí)驗(yàn)旨在測IFN-γ的分泌情況,T細(xì)胞受抗原刺激后分泌IFN-γ,同時(shí)被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細(xì)胞被移除并清洗后,被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志,其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用,并加入酵素受質(zhì)使其呈色,有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下約10-20mm大小染色的斑點(diǎn)。方法:(1)獲得PBMC(2)IFN-γ誘導(dǎo)分泌:陽性對照品加入PMA,陰性對照不加刺激物。(3)主要方法:處理PVDF孔板,在活化后預(yù)包被好抗體的平板中分別加入陰性PBMC及陽
2、性PBMC,37℃孵育。第二天洗板后,加緩沖液后,孵育。清洗,加入稀釋的檢測抗體,孵育1小時(shí),洗板后再加入親和素堿性磷酸酶再次孵育。最后加入BCIP/NBT顯色,倒去液體,將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后,4℃下放置一夜后讀取點(diǎn)數(shù),計(jì)算待測樣本中IFN-γ的含量,從而評估T細(xì)胞的功能。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色原理:通過體外多克隆激活劑或特定的抗原激活T細(xì)胞,同時(shí)抑制IFN-γ釋放到細(xì)胞外,使之在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓄積,信號增強(qiáng)。增加細(xì)胞膜的通透性后,用抗細(xì)胞因子的抗體與胞內(nèi)特定的分子相結(jié)合,通過非相關(guān)特異性同型匹配的抗體作為對照
3、,以確定靜止的與無細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞的最小熒光背景,這樣就可以用流式細(xì)胞儀檢測不同細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子。方法:取T細(xì)胞,用PMA和Ionomycin同時(shí)刺激后孵育→→加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)→→細(xì)胞表面染色→→固定,破膜→→重懸細(xì)胞→→加入熒光標(biāo)記抗體,避光→→緩沖液重懸,流式細(xì)胞儀檢測→→結(jié)果分析二、蛋白水平ELISA原理:本實(shí)驗(yàn)所測T細(xì)胞分泌的IFN-γ有多個(gè)表位,采用雙抗體夾心法來測含量,IFN-γ與酶結(jié)合后不改變其原有的特異性及免疫反應(yīng)性,同時(shí)也不影響酶的催化效能。當(dāng)存在相應(yīng)的酶底物時(shí),酶能催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物
4、,顏色的有無和深淺可以反映IFN-γ的分泌情況。方法:(1)獲得PBMC:將采集的靜脈血置于肝素抗凝試管中,每份分別用等量RPMI1640培養(yǎng)液稀釋,以淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC。(2)IFN-γ誘導(dǎo)分泌:陽性組每孔加入一定量PHA,陰性組不加PHA。細(xì)胞經(jīng)37℃5%CO2,培養(yǎng)72h,2000rmp高速離心20min,取上清液。(3)主要方法:用一抗包被,放置在反應(yīng)板中4℃過夜。洗滌三次,將已知含量的IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋于各孔中,并設(shè)置陽性組、陰性對照組、空白對照組。加樣后,孵育,洗滌。每孔加入酶,再次孵育,洗滌。加
5、入底物后顯色,讀取OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)參考蛋白的含量計(jì)算待測樣本中IFN-γ的含量,從而評估T細(xì)胞的功能。Westernblot原理:IFN-γ在本質(zhì)上屬于蛋白質(zhì),因此可以采用Western-Blot進(jìn)行檢測。經(jīng)過SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持原有的物質(zhì)類型和生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。方法:
6、蛋白質(zhì)樣品獲得→→制膠(1%瓊脂糖封底;裝配電泳槽;灌注分離膠;灌注濃縮膠)→→樣品處理→→電泳→→轉(zhuǎn)移→→免疫學(xué)檢測(封閉過夜;一抗37°C1h洗3次;二抗37°C1h洗3次;底物顯色5-15分鐘;ddH2O洗滌)→→結(jié)果檢測三、基因水平Northernblot原理:采用瓊脂糖凝膠電泳,將分子量大小不同的RNA分離開來,隨后將其原為轉(zhuǎn)移至固相支持物(硝酸纖維素膜)上,再用放射性(或非放射性)標(biāo)記的DNA或RNA探針,依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交,最后進(jìn)行放射自顯影(或化學(xué)顯影),以目標(biāo)RNA所在位置表示其分子量的大小,而其顯影強(qiáng)
7、度則可提示目標(biāo)RNA在所測樣品中的相對含量(即目標(biāo)RNA的豐度)雖然Northern也可檢測目標(biāo)mRNA分子的大小,但更多的是用于檢測目的基因在組織細(xì)胞中有無表達(dá)及表達(dá)的水平如何。方法:總RNA提取→→變性膠的制備→→樣品制備→→電泳→→將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上→→轉(zhuǎn)移完畢后,凝膠置紫外燈下,觀察是否有殘留RNA→→膜烤干保存→→探針的制備→→探針的純化及比活性測定→→預(yù)雜交→→探針標(biāo)記→→雜交→→洗膜→→壓片暗盒中自顯影→→去除膜上的探針RT-PCR原理:將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(P
8、CR)相結(jié)合的技術(shù)。對T細(xì)胞的總RNA進(jìn)行抽提,以其中的mRNA作為模板,在Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,把RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后設(shè)計(jì)IFN-γ基因引物進(jìn)行PCR,通過分析電泳條帶灰度值,得出IFN-γ基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相對量的變化,從而檢測T細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)水平。方法:T細(xì)胞總RNA