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《熒光標(biāo)記mrna差異顯示技術(shù)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、熒光標(biāo)記mRNA差異顯示技術(shù)mRNA差異顯示技術(shù)（differentialdisplay，DD）是用于研究基因的差異表達(dá)的新方法。該技術(shù)自1992年被首次報(bào)道后，即以其不可替代的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在應(yīng)用過程中不斷得到改進(jìn)，并產(chǎn)生了諸多衍生技術(shù)如RPA（RNAfingerprintingbyarbitrarilyprimedPCR）、GDD（genomicDD）等。本文簡(jiǎn)要介紹在本試驗(yàn)室熒光標(biāo)記差異顯示技術(shù)（fluorescentDD，F(xiàn)DD）的應(yīng)用及體會(huì)。1.材料與方法1.1標(biāo)本人單核細(xì)胞系U937，細(xì)胞
2、密度2×108/L，分對(duì)照組（N）、處理Ⅰ組（T1）、處理Ⅱ組（T2），N用1640培養(yǎng)基及10%胎牛血清培養(yǎng)，T1用IFN-γ104U/LLPS1μg/L、T2用IFN-γ10U/LLPSl0μg/L分別刺激7h.1.2主要試劑與儀器TRIzol試劑（GIBCOBRL）、FluoroDD試劑盒（Genomyx）、SupersriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶（GIBCO?BRL）、AmpliTaqDNA聚合酶（GIBCOBRL）、RNase-freeDNaseI（Promega）；GenomyxLR、GenomyxSC、DNATh
3、ermalCycler（PerkinElmer）1.3總RNA的制備按試劑盒提供的方法分別提取三種細(xì)胞的總RNA,以RNase-freeDNaseI（終濃度80000U/L）除去其中污染的DNA,經(jīng)甲醛變性凝膠電冰鑒定其完整性，并以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度1.4mRNA差異顯示1.4.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)選擇錨定引物[T7（dT12）AP(anchoredprimers，AP)]，序列為5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中M=A/G/C。N=A/G/C/T],以總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄
4、反應(yīng)，每管反應(yīng)體系如下：總RNAl.0μg，AP4pmol，70℃5min，加入50mmol/LTris-HCl（pH8.3），75mmol/LKCl，3mmol/LMgCl2，10mmol/LDTT，25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ60Units，總反應(yīng)體系20μl，42℃5min，50℃50min，70℃15min。1.4.2熒光標(biāo)記差異顯示PCR?選取與逆轉(zhuǎn)錄引物序列相同的帶熒光物質(zhì)標(biāo)記的錨定引物[TMR-T7(dT12)AP]，隨機(jī)引物（5'ACAATTTCACAC
5、AGGAACGCTAGTTG3'），以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：20mmol/LTris-HCl（pH8.4），50mmol/LKCl,3.75mmol/LMgCl2，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.0μl，50μmol/LdNTPmix（1∶1∶1），0.35μmol/L5'-隨機(jī)引物，0.35μmol/L3-錨定引物，AmpliTaq0.5Units，總反應(yīng)體系10μl。反應(yīng)步驟如下：95℃2min；94℃15s，50℃30s，72℃2min，4個(gè)循環(huán)；94℃15s，60℃30s，72℃2min，個(gè)循環(huán)；72
6、℃延伸7min。1.4.3分離差異顯示片段配制5.6%變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.25mm，大小61×33cm。將PCR產(chǎn)物加4.0μl上樣緩沖液，95℃變性后上樣。3000V、100W、55℃電泳4.5h。干膠后置于GenomyxSC掃描，用系統(tǒng)所帶的AcquireSCprogram軟件分析處理掃描結(jié)果。1.4.4回收差異條帶用AcquireSC軟件將差異條帶定位，用一次性手術(shù)刀片切割下所需條帶，置于30μl去離子水中，37℃水浴30-60min，備用。1.4.5差異條帶的再擴(kuò)增以經(jīng)上述處理的回收條帶為模板，T7啟
7、動(dòng)子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3'）為引物，進(jìn)行再擴(kuò)增反應(yīng)：模板2.0μl，20mmol/LTris-HCl（pH8.4），50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2,20μmol/LdNTPmix（1∶1∶1∶1），0.2μmol/LT7、0.2μmol/LM13-r、AmpliTaq1.0Units，總反應(yīng)體系20μl.反應(yīng)條件同差異顯示PCR。2.結(jié)果2.1總RNA的質(zhì)量總R
8、NA經(jīng)DnaseI處理，用1.0%甲醛變性凝膠電泳，可見清楚的28S、18S、5S條帶，且28S/18S約為2∶1（圖1），表明RNA完整性好，無降解現(xiàn)象。N、T1、T2的OD260/OD280比值分別為1.92、1.83、1.98，表明樣品純度高。Fig.1ResultoftotalRNAonformaldehyde-agarosegel2.
