高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類化合物

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1、高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類化合物趙淑杰韓梅韓忠明李彥穎楊利民【摘要】采用高速逆流色譜(HSCCC)與其它色譜聯(lián)用的方法分離純化鹿藥中的化學(xué)成分，得到5個(gè)黃酮類化合物：5,7,3＇,4＇四羥基3甲氧基8甲基黃酮(1)、8甲基木犀草素(2)、3＇甲氧基木犀草素(3)、木犀草素(4)和槲皮素(5)，它們均為首次自該種及該屬植物中分離得到。HSCCC以V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=4∶3∶2混合液為溶劑，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，分離純化得到3個(gè)分別含化合物1，4和5的主要部分，經(jīng)HPLC檢驗(yàn)純度分別為98.3%，96.7%和95.3%;還有1個(gè)含有化合物

2、2和3的較純部分，通過SephadexLH20柱色譜，以V(甲醇)∶V(水)=1∶1混合液洗脫將二者分離。通過理化性質(zhì)及紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁等波譜分析確定化合物結(jié)構(gòu)?！娟P(guān)鍵詞】鹿藥，高速逆流色譜，黃酮類化合物，木犀草素，槲皮素　1引言　　鹿藥為百合科鹿藥屬植物鹿藥(SmilacinajaponicaA.Gray)的干燥根莖，是我國(guó)民間常用中藥[1]?！吨兴幋筠o典》中記載，性味“甘、苦、溫，無毒”，具有補(bǔ)氣益腎、祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)功能，用于治療風(fēng)濕骨痛、神經(jīng)性頭痛、乳腺炎、月經(jīng)不調(diào)、癰癤腫毒及跌打損傷等[2]。鹿藥屬植物全世界約有25種，我國(guó)有14種，2個(gè)變種[3]，幾乎全

3、國(guó)各地都有所分布，資源十分豐富，許多種為藥食兩用植物，根莖入藥[4]，地上幼嫩部分是受人們喜愛的山野菜。已有人從中分離出皂苷類化合物，藥理研究表明其具有抗真菌和抗腫瘤活性[5,6]。吉林省中西部地區(qū)分布有鹿藥、興安鹿藥(S.dahuricaTurcz.exFisch.etMey)和三葉鹿藥(S.trifoliaDesf)，野生資源儲(chǔ)量很大，特別是鹿藥，但尚未得到有效的研究、開發(fā)與利用。對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，將為探明其藥用功效和開發(fā)新藥源提供參考依據(jù)。　　高速逆流色譜(HSCCC)與傳統(tǒng)色譜相比，具有對(duì)樣品無不可逆吸附、儀器操作簡(jiǎn)單、分離量大、樣品易回收、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此被

4、廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離制備[7]?！　”狙芯坎捎酶咚倌媪魃V結(jié)合其它色譜，從鹿藥中分離出5,7,3＇,4＇四羥基3甲氧基8甲基黃酮、8甲基木犀草素、3＇甲氧基木犀草素、木犀草素和槲皮素共5個(gè)黃酮類化合物。2實(shí)驗(yàn)部分　　2.1儀器、試劑與材料　　DL1000E智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);TBE300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術(shù)有限公司);N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司);1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司);FTIR8400S紅外光譜儀，UV1700紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);AV400核磁共振儀(

5、瑞士Bruker公司);MATLCQ電噴霧質(zhì)譜儀(美國(guó)Finigan公司)。D101型大孔樹脂(天津市海光化工有限公司);SephadexLH20(Pharmacia產(chǎn)品);甲醇與乙腈為色譜純(美國(guó)FisherChemAlertGuide公司);水為純凈水;其余試劑為分析純?！　÷顾幉勺约质【排_(tái)市土門嶺地區(qū)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊利民教授鑒定確認(rèn)。將其洗凈后自然陰干，機(jī)械粉碎，備用?！　?.2樣品制備　　取粉碎的鹿藥根莖2.80kg，加5倍體積的90%乙醇超聲提取3次，合并濾液并減壓濃縮至無醇味;將浸膏水溶后過D101大孔樹脂柱，依次用水及30%，50%，70%和90

6、%的乙醇洗脫，每次洗脫至流出液無色為止，將各洗脫部分濃縮至干，備用。取70%乙醇洗脫部分(12g)干法上硅膠柱(粒徑0.098～0.05mm)，V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1～2∶8，梯度洗脫，得7個(gè)流份;選取其中流份Ⅰ(0.993g)和流份Ⅱ(0.490g)作為樣品進(jìn)行HSCCC分離?！　?.3兩相溶劑的選擇　　選擇兩相溶劑系統(tǒng)是通過目標(biāo)化合物的分配系數(shù)K來確定的。K值通過HPLC檢測(cè)確定，步驟如下：取大約1mg樣品放入試管中，加入已平衡的兩相溶劑系統(tǒng)，上、下相溶劑各2.0mL，充分振搖溶解后靜置分層，分別取上、下相用HPLC檢測(cè)，上相和下相的峰面積分別為AU和AL，分配系

7、數(shù)K=AU/AL?！　?.4高效液相色譜分析　　采用HPLC檢測(cè)流份Ⅰ和Ⅱ的成分及經(jīng)HSCCC分離后各色譜峰的純度。HPLC分析條件：DikmaC18色譜柱(200mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈水,梯度洗脫：0min,30%乙腈;20min,35%乙腈;30min,40%乙腈;40min,50%乙腈。流速l.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;柱溫30℃?！　?.5高速逆流色譜分離條件　　按V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=4∶3∶2將所有溶劑加入分液漏斗中，充分振搖后靜置24h分相;上相