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1、黃芩苷對(duì)人外周血T細(xì)胞TCRVβmRNA表達(dá)的影響論文龔淑琪，傅穎媛，孫午，姜青龍，舒奇【摘要】目的研究黃芩苷對(duì)人外周血T細(xì)胞表面TCRVβmRNA表達(dá)的影響及其可能受體。方法采用尼龍毛柱法分離T淋巴細(xì)胞，將其分為空白對(duì)照組（T1）、黃芩苷組（T2）、抗體封閉用藥組（T3）、抗體封閉對(duì)照組（T4），37℃培養(yǎng)48h，Trizol法提取總RNA.freelRNA表達(dá)。結(jié)果T2組較T1組TCRVβmRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)（P﹤0.01）；T3組較T2組TCRVβmRNA的表達(dá)明顯減低（P﹤0.01）；T3組較T4組TCRV
2、βmRNA的表達(dá)增高（P0.05）。結(jié)論黃芩苷能顯著增加T細(xì)胞表面TCRVβmRNA的表達(dá)；T細(xì)胞受體（TCRαβ）是黃芩苷作用于T細(xì)胞的主要受體之一?！娟P(guān)鍵詞】黃芩苷；T細(xì)胞受體；TCRVβmRNA；實(shí)時(shí)熒光RT-PCRAbstract：ObjectiveTostudytheeffectofbaicalinonthemRNAexpressionofTCRvβonthesurfaceofhumanperipheralbloodTcellsandexplorethepossiblereceptorforbaicalin
3、.MethodsTcellsnmethod,anddiuidedintofourgroups:blankcontrolgroup(T1),baicalingroup(T2),antibodyblocking4druggroup(T3)andblockingcontrolgroup(T4).Afterincubationfor48h,theTCRvβmRNAexpressionindifferentgroupsefluorescentRT-PCR.Results1.TheTCRvβexpressionofT2group
4、provetheTCRvβexpressionsignificantlyandtheTCRαβisoneofthemajorreceptorsforbaicalinKeyRNA;Real-timefluorescentRT-PCR黃芩是一種唇形科多年生草本植物的干燥根，作為藥用已有上千年的歷史，其味苦、性寒，具有清熱解毒、涼血止血、除熱安胎的功效。其主要活性成分黃芩苷（分子式C21H18O11、分子量446.35）是一種黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗病毒［1］，抗炎癥［2］，抗腫瘤［3］及免疫調(diào)節(jié)的作用［4］。其
5、中對(duì)黃芩苷免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，尤其是抗病毒、抗腫瘤方面的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制已成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一，但目前的研究大多局限于細(xì)胞水平。本實(shí)驗(yàn)在本室既往摸索的黃芩苷最佳體外作用濃度及促進(jìn)T、B細(xì)胞體外增殖研究的基礎(chǔ)上，從黃芩苷對(duì)TCRvβmRNA表達(dá)的影響入手，結(jié)合抗體封閉技術(shù)，試圖從分子水平上探索黃芩苷作用T細(xì)胞表面的可能受體。1材料與儀器1.1細(xì)胞及藥品人外周血濃縮白細(xì)胞購自江西省血液中心，黃芩苷由江西省中醫(yī)藥研究所提供（純度＞98%）。1.2試劑及儀器鼠抗人TCR（αβ）單克隆抗體（美國BD公司），RevertAi
6、dTMFirstStrandcDNASynthesisKit（MBI公司），Trizol試劑、SYBRGreenqPCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），MyiQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）。1.3qPCR引物由PrimierPrimer5.0軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin（β-肌動(dòng)蛋白）為內(nèi)參基因，序列如下：TCRvβ(XM_001716513)141bpForl。2.2實(shí)驗(yàn)分組按表1分組加樣后轉(zhuǎn)種于24孔板上，置37℃5%CO2箱培養(yǎng)48h。表1T細(xì)胞分組加樣表（略
7、）2.3總RNA提取及鑒定①利用Trizol試劑提取總RNA。②100V、1%瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA完整性。③紫外分光光度計(jì)測定OD260/OD280，在1.80～2.0之間，說明純度較好，并計(jì)算總RNA的濃度。2.4實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR以5μg總RNA為模板按試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μl。qPCR反應(yīng)體系為50μl：cDNA1μl、上游引物1μl、下游引物1μl、SuperMix25μl、SYBRGreenDye1μl、Mg2+2μl補(bǔ)足雙蒸水至50μl。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，取
8、三孔的平均值分析。qPCR擴(kuò)增程序：Cycle1:(1×)95.0℃for05:00;Cycle2:(45×)95.0℃for00:15,53.0℃for00:30,72.0℃for00:30，72.0℃延升階段收集熒光信號(hào)。循環(huán)結(jié)束后增加熔點(diǎn)曲線程序以觀察產(chǎn)物特異性：Cycle3:(1×):95.0℃for01:00;Cycle4:(1×)5
