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1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷論文顏濱余錚李振宇閆洪印【摘要】目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對(duì)脊髓損傷與修復(fù)的作用與機(jī)制及細(xì)胞移植的方法與途徑。方法：實(shí)驗(yàn)組為將體外培養(yǎng)SD大鼠的MSCs經(jīng)綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染標(biāo)記后顯微注射于脊髓橫斷模型的脊髓損傷處，并以無(wú)血清培養(yǎng)基注射動(dòng)物為對(duì)照組。12周后觀察移植細(xì)胞的分化情況，并通過(guò)行為學(xué)、組織學(xué)及免疫組化的方法評(píng)價(jià)脊髓功能變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組MSCs移植12周后，脊髓功能明顯恢復(fù)。結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓的損傷修復(fù)具有明顯作用?！娟P(guān)鍵詞
2、】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；脊髓損傷；細(xì)胞培養(yǎng)〔Abstract〕ObjectiveToinvestigatethemethodsthathoodles.Beforethetransplanting,theMSCsmunohistochemistryandangiogenesisentobtainedthehighpureMSCs.TheMSCscanstabilizetospreadthegenerationtobinethecord.ConclusionThetransplantationusing
3、thecellsprovedthatMSCsayalloalstemcells;Transplante;Spinalcordinjury;Cultureofcell脊髓損傷的修復(fù)是近年熱點(diǎn)課題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）由于具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，可用來(lái)作為細(xì)胞移植的供體細(xì)胞來(lái)源1。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將MSCs移植于損傷的脊髓，研究其在缺血微環(huán)境下的分化增殖潛能以及其對(duì)于脊髓損傷的作用。1材料和方法1試劑與儀器IMDM（Iscove'somdifiedDu
4、lbecco'smedium），Gibco公司；胎牛血清（FBS）Hyclone公司；分離液，胰蛋白酶和EDTA；可吸收性明膠海綿.freelin，無(wú)菌條件下取下肢長(zhǎng)骨，顯露骨髓腔，用含15%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔獲取骨髓細(xì)胞，將沖洗液收集于離心管中，2000r/min離心15min，棄上清及脂肪層，取沉淀，用IMDM培養(yǎng)液混勻，輕輕地層加到比重為1077g/mL的淋巴細(xì)胞分離液上，2000r/min離心10min，收集中間的單核細(xì)胞層。用IMDM培養(yǎng)液1000r/min離心洗滌10min
5、，然后收集細(xì)胞，用含15%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃含5%的CO2孵箱中培養(yǎng)，每3d換液1次，原代細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用0.25%胰酶和0.1%EDTA消化后按1:3的比例傳代。移植前對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)染。離心并計(jì)數(shù)細(xì)胞2。1.2.2大鼠脊髓橫斷模型的建立及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植按40mg/kg劑量麻醉大鼠，麻醉后固定于立體定向儀上，以T10為中心，設(shè)計(jì)切口。在顯微鏡下，無(wú)菌操作切除T10全椎板及T9、T11部分椎板，顯露脊髓，剪開(kāi)硬膜及軟膜，以特制探針橫預(yù)置
6、3-0絲線于待損傷脊髓腹側(cè)硬膜外。外剃須刀片于預(yù)置線頭側(cè)0.5mm（T9水平）將脊髓橫斷，順利由腹側(cè)向背側(cè)提出預(yù)置線，明膠海綿輕柔壓迫止血。5L的微量注射器預(yù)制微量注射管道，預(yù)制玻璃電極作為顯微注射針頭，外徑100m，內(nèi)徑80m，高壓消毒；在距脊髓斷端選用1mm的平面與正中線交點(diǎn)為進(jìn)針點(diǎn)，每一進(jìn)針點(diǎn)的不同深度1.75、1.25、1.00mm和0.50mm分別注射0.5L（50000個(gè)），總計(jì)每側(cè)端植入200000個(gè)。兩斷端分別注射，注射速度0.1L/min，每注射位點(diǎn)留針5min。無(wú)細(xì)胞移植組（空白對(duì)
7、照），用同樣方法及部位注射0.5L的無(wú)血清的D/F12培養(yǎng)液。1.2.3術(shù)后大鼠的飼養(yǎng)及護(hù)理常規(guī)方法籠內(nèi)飼養(yǎng)，術(shù)后3~7d內(nèi)視情況給予青霉素500U/200g，腹腔注射，每日8:00、16:00各擠尿1次，夜間不喂水，大鼠體重變化的觀察，用天平準(zhǔn)確稱量1~20號(hào)大鼠重量，精確到克，術(shù)后1、2、3、4周分別稱重記錄。1.2.4應(yīng)用BBB法對(duì)存活的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)3主要觀察：后肢髖、膝、踝關(guān)節(jié)的活動(dòng)度；軀干及腹部的狀態(tài)：是否有畸形；行走時(shí)是否穩(wěn)定；腹部是否貼地。后爪的著地狀態(tài)。行走步態(tài)：是否有行走；是
8、否協(xié)調(diào)；是否有彈趾動(dòng)作。后爪觸地和離地時(shí)的狀態(tài)：內(nèi)旋，外旋，平行。尾部狀態(tài)。分別在術(shù)后4、6、8、9、10、11、12周對(duì)存活的24只大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)情況進(jìn)行觀察，觀察每只大鼠左右肢功能，按照量表打分，統(tǒng)計(jì)處理。1.2.5順行示蹤標(biāo)記4原切口入路，顯露原脊髓橫斷處，選取距橫斷水平頭側(cè)5mm為示蹤劑注射平面，正中及旁開(kāi)0.5mm為垂直進(jìn)針點(diǎn)。中央進(jìn)針點(diǎn)的不同深度1.75、1.25、1.00mm和0.50mm，兩旁側(cè)進(jìn)針點(diǎn)不同深度為1.50、1.25、1.
