骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷

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1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷【摘要】脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是一種臨床上常見的以損傷平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)功能完全喪失和大小便失禁為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷。由于神經(jīng)元本身再生能力不足及損傷局部缺乏適宜的再生微環(huán)境，脊髓損傷的治療成為醫(yī)學(xué)界研究的難題。近年來，隨著神經(jīng)生物學(xué)和干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞移植成為治療脊髓損傷的新希望和新方法。目前可供選擇的移植細(xì)胞類型有胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemce

2、lls,BMSCs)和成纖維細(xì)胞等，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以其強(qiáng)大的增殖和分化能力，取材方便，易于分離培養(yǎng)和低免疫源性等特征而被廣泛用于疾病研究及治療，因此探索BMSCs移植治療SCI具有重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)旨在研究BMSCs的不同移植方式對(duì)于SCI治療效果的比較，為臨床BMSCs移植治療SCI尋找一種更有效的移植方式?！娟P(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞移植；脊髓損傷【中圖分類號(hào)】R459【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1004-7484(2013)03-0039-04材料和方法1.大鼠BMSCs的培養(yǎng)健康雄性Wista

3、r大鼠，SPF級(jí)，年齡30天左右，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005o全骨髓貼壁法：取一月齡Wistar大鼠，斷頸處死；嚴(yán)格無菌條件下取大鼠的雙側(cè)后肢的股骨和脛骨，去除骨表面的肌肉組織,Hanks液清洗，剪去骨聽端，暴露骨髓腔；用5ml的無菌注射器吸取Hanks液沖洗骨髓腔，收集沖出的骨髓細(xì)胞，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液；而后接種在T25的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37匸、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。首次換液時(shí)間為第3天，以后每3天更換培養(yǎng)液一次。待細(xì)胞融合達(dá)到70%開始傳代。BrdU標(biāo)記取實(shí)驗(yàn)

4、中培養(yǎng)的第4代BMSCs用于移植，移植前24h更新培養(yǎng)基，加入BrdU,終濃度為10?mol/l,移植前將細(xì)胞制成PBS懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為3X104/?!o2?大鼠脊髓損傷模型的建立[1-3]健康雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，體重250g-300g,由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005o大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天后開始造模，造模前禁食12h,腹腔注射戊巴比妥鈉（45-50mg/kg）,備皮消毒，鋪無菌洞巾，尋找胸椎T9-11，沿正中切開皮膚，經(jīng)鈍性分離筋膜與肌肉，暴露脊椎，打開

5、椎板，暴露脊髓，脊髓右側(cè)半橫斷損傷，肌肉筋膜皮膚分層縫合，消毒貼創(chuàng)可貼，青霉素肌肉注射50萬單位/次。術(shù)后護(hù)理：術(shù)后前三天每天三次膀胱按摩,術(shù)后一周每三天肌肉注射青霉素一次。每周BBB(bassobeattieandbresnahan,BBB)評(píng)分一次。實(shí)驗(yàn)分組與項(xiàng)目觀察將32只Wistar大鼠隨機(jī)分為四組：(A)尾靜脈注射PBS(ipbs),8只;(B)脊髓局部靶點(diǎn)注射PBS(lpbs),8只;(C)尾靜脈注射BMSCs細(xì)胞懸液(ibmsc),8只；(D)脊髓局部靶點(diǎn)注射BMSCs細(xì)胞懸液(lbmsc),8只。

6、觀察項(xiàng)目：每周進(jìn)行一次BBB評(píng)分，于細(xì)胞移植后第4W、8W取材觀察脊髓損傷修復(fù)的情況。3.BMSCs移植實(shí)驗(yàn)組在脊髓損傷1周后，分別進(jìn)行尾靜脈注射和脊髓局部靶點(diǎn)注射，尾靜脈注射組:1ml注射器從尾靜脈注射，注射后留針30s?60s；局部靶點(diǎn)注射組:10?1微量注射器在距損傷區(qū)大約0.5cm的上下四個(gè)點(diǎn)注射10?1細(xì)胞懸液(第4代BMSCs,密度均為3X104/71),進(jìn)針深度1.5mm?l?6mm；對(duì)照組：以同樣的方法注射等量的PES,注射后留針30s?60so4.行為學(xué)評(píng)估所有大鼠在術(shù)后lw,2w,3w,4w,

7、5w,6w,7w和8w進(jìn)行BBB評(píng)分，完全癱瘓0,正常為21o評(píng)分采用雙人雙盲法,即參與評(píng)分的兩個(gè)人不參與實(shí)驗(yàn)，但對(duì)該實(shí)驗(yàn)又有所了解，而且各自評(píng)分最后取其平均值。所有評(píng)分均在晚上進(jìn)行。3.脊髓組織的灌流固定在脊髓損傷后隨機(jī)取各組大鼠在不同時(shí)間(2w、4w、8w)的組織標(biāo)本，用戊巴比妥鈉(40-50nig/kg)腹腔注射，待麻醉起效后，剪開皮膚、皮下、肌肉、肋骨，開胸;暴露心臟，可見左右心室、左右心房及心臟搏動(dòng)，用眼科小平鑲提起心臟，用小剪刀剪破左心尖，插入小塑料管入升主動(dòng)脈，塑料管末端連接注射器，用止血鉗輕輕夾住

8、固定，先快速推注濃度為10萬單位/100ml的肝素鈉40ml,然后用80mlPBS沖洗，待右心房流出的沖洗液清亮后，用4%多聚甲醛150ml心內(nèi)灌注，灌注時(shí)可見四肢及軀體的肌肉抽動(dòng)，右心房流出的沖洗液具有氨味，灌注固定30min；剪開原背部切口皮膚，剔除紙棘肌，以損傷區(qū)域?yàn)橹行模靡Ч倾Q咬去上下節(jié)段的椎板、關(guān)節(jié)突,暴露損傷段及鄰近節(jié)段的脊髓,取長約4?的脊髓段，在41冰箱