miz1基因sirna表達(dá)載體的構(gòu)建及影響hela細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性的論文

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1、miz1基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及影響HeLa細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性的論文作者：劉學(xué)武,沈嵐,張健,劉新平【摘要】目的：構(gòu)建針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子miz1基因的sirna表達(dá)載體，觀察其影響hela細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性.方法：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)miz1基因的sirna寡核苷酸，克隆入sirna表達(dá)載體,脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入hela細(xì)胞中,用rtpcr檢測(cè)miz1基因的mrna表達(dá)水平,用iz1蛋白表達(dá)水平，用mtt法檢測(cè)hela細(xì)胞活力.結(jié)果：dna測(cè)序和酶切鑒定證明針對(duì)miz1基因的sirna表達(dá)載體構(gòu)建成功，rtpcr和iz1基因的mrna表達(dá)和蛋白表達(dá).與對(duì)照組相比

2、，轉(zhuǎn)染上述干擾載體后的hela細(xì)胞，在加入阿霉素12h后,細(xì)胞活力明顯降低（p<0.05），并且干擾質(zhì)粒與阿霉素存在交互作用（p<0.05），以加入阿霉素12h和24h后最明顯.結(jié)論：針對(duì)miz1基因的sirna能夠抑制人宮頸癌細(xì)胞系hela中miz1基因的表達(dá)并能增強(qiáng)hela細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性.【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)錄因子miz1；rna干涉；轉(zhuǎn)染；阿霉素0引言化療是腫瘤治療的常規(guī)手段，拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅱ抑制劑阿霉素作為常用的化療藥物之一，其能引起dna斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且這一作用與靶細(xì)胞內(nèi)某些基因如cmyc的表達(dá)水平密切相關(guān).miz1為myc相互作用的

3、鋅指蛋白，屬于pozzf轉(zhuǎn)錄因子家族成員［1］.目前發(fā)現(xiàn)miz1能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化［2］，并與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［3］.在輻射引起細(xì)胞dna損傷時(shí)，miz1的敲弱可使細(xì)胞從g1期阻滯走向凋亡［4］，當(dāng)阿霉素引起dna損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，miz1的表達(dá)異?？赡軙?huì)影響阿霉素對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果.為探討miz1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感性的關(guān)系，我們采用rnai技術(shù)，構(gòu)建了針對(duì)miz1的sirna的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入人宮頸癌細(xì)胞系hela,通過(guò)半定量rtpcr以及免疫印跡檢測(cè)內(nèi)源性miz1的表達(dá)并采用mtt法檢測(cè)hela細(xì)胞的活力，為進(jìn)一步研究miz1影響腫瘤細(xì)

4、胞對(duì)阿霉素的敏感性機(jī)制提供依據(jù).1材料和方法1.1材料psilencertm3.1h1neo載體（美國(guó)ambion公司）；rna反轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)promega公司)；各種限制性內(nèi)切酶，t4dna連接酶和pcr試劑（美國(guó)gibco公司）；dna提取及回收試劑盒（上海華舜公司）；lipofectamim2000（美國(guó)invitrogen公司）；odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)licor公司）；大腸桿菌dh5α菌種，人宮頸癌細(xì)胞系hela（第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存）；寡核苷酸片段（上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成）；抗miz1抗體（美國(guó)sa

5、ntacruz公司）；irdyetm800紅外熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗（美國(guó)rockland公司）.1.2方法1.2.1psilencertm3.1h1neomiz1基因載體的構(gòu)建針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子miz1基因的編碼區(qū)選取19個(gè)核苷酸作為sirna作用靶點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成兩條寡核苷酸片段，5′gatcccgccttacctgtgtgataagttcaagagacttatcacacaggtaaggcttttttggaaa3′及5′agcttttccaaaaaagccttacctgtgtgataagtctcttgaacttatcacacaggtaaggcgg3′，其

6、中g(shù)atcc為bamhⅰ酶切位點(diǎn)，agctt為hindⅲ酶切位點(diǎn),gccttacctgtgtgataag為設(shè)計(jì)的sirna序列，ttcaagaga轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾環(huán).將上述兩條寡核苷酸片段分別溶于雙蒸水中至終濃度為50pmol/l.30μl退火體系中加入：10×退火緩沖液3μl，兩種寡核苷酸片段各13.5μl.加熱至95℃，于37℃恒溫孵箱內(nèi)放置2h.退火產(chǎn)物與線性化的psilencertm3.1h1neo載體連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，提取質(zhì)粒，選取載體中的ecori酶切位點(diǎn)和克隆片斷中的hindⅲ酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，鑒定片段是否插入目的載體中，選取陽(yáng)性

7、克隆由上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，以確定其是否為目的片段.同時(shí)設(shè)計(jì)非特異性序列：5′ttctccgaacgtgtcacgt3′，與人類基因無(wú)同源性，可以作為陰性對(duì)照.1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染將人宮頸癌細(xì)胞系hela以5×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，50ml/lco2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染操作方法按照l(shuí)ipfectamim2000說(shuō)明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48h后收取細(xì)胞樣品，用于rtpcr和蛋白印跡檢測(cè).1.2.3rtpcr檢測(cè)運(yùn)用軟件primerpremier5.0針對(duì)miz1基因的cdna設(shè)計(jì)引物，其上游引物為：5

8、′gatgacatggtcacgct