miz1基因sirna表達(dá)載體的構(gòu)建及影響hela細(xì)胞對阿霉素的敏感性

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1、miz1基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及影響HeLa細(xì)胞對阿霉素的敏感性：劉學(xué)武,沈嵐,張健,劉新平【摘要】目的：構(gòu)建針對轉(zhuǎn)錄因子miz1基因的siRNA表達(dá)載體，觀察其影響HeLa細(xì)胞對阿霉素的敏感性.方法：設(shè)計并合成針對miz1基因的siRNA寡核苷酸，克隆入siRNA表達(dá)載體,脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞中,用RTPCR檢測miz1基因的mRNA表達(dá)水平,用iz1蛋白表達(dá)水平，用MTT法檢測HeLa細(xì)胞活力.結(jié)果：DNA測序和酶切鑒定證明針對miz1基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，RTP

2、CR和iz1；RNA干涉；轉(zhuǎn)染；阿霉素0引言化療是腫瘤治療的常規(guī)手段，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑阿霉素作為常用的化療藥物之一，其能引起DNA斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且這一作用與靶細(xì)胞內(nèi)某些基因如cmyc的表達(dá)水平密切相關(guān).Miz1為Myc相互作用的鋅指蛋白，屬于POZZF轉(zhuǎn)錄因子家族成員［1］.目前發(fā)現(xiàn)Miz1能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化［2］，并與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［3］.在輻射引起細(xì)胞DNA損傷時，Miz1的敲弱可使細(xì)胞從G1期阻滯走向凋亡［4］，當(dāng)阿霉素引起DNA損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時，Miz1的表達(dá)異?？?/p>

3、能會影響阿霉素對靶細(xì)胞的殺傷效果.為探討Miz1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對阿霉素敏感性的關(guān)系，我們采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建了針對Miz1的siRNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入人宮頸癌細(xì)胞系HeLa,通過半定量RTPCR以及免疫印跡檢測內(nèi)源性Miz1的表達(dá)并采用MTT法檢測HeLa細(xì)胞的活力，為進(jìn)一步研究Miz1影響腫瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性機(jī)制提供依據(jù).1材料和方法1.1材料pSilencerTM3.1H1neo載體（美國Ambion公司）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Promega公司)；各種限制性內(nèi)切酶，T4DNA連

4、接酶和PCR試劑（美國Gibco公司）；DNA提取及回收試劑盒（上海華舜公司）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）；大腸桿菌DH5α菌種，人宮頸癌細(xì)胞系HeLa（第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存）；寡核苷酸片段（上海基康生物技術(shù)有限公司合成）；抗Miz1抗體（美國SantaCruz公司）；IRDyeTM800紅外熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗（美國Rockland公司）.1.2方法1.2.1pSilen

5、cerTM3.1H1neomiz1基因載體的構(gòu)建針對轉(zhuǎn)錄因子miz1基因的編碼區(qū)選取19個核苷酸作為siRNA作用靶點(diǎn),設(shè)計并合成兩條寡核苷酸片段，5′GATCCCGCCTTACCTGTGTGATAAGTTCAAGAGACTTATCACACAGGTAAGGCTTTTTTGGAAA3′及5′AGCTTTTCCAAAAAAGCCTTACCTGTGTGATAAGTCTCTTGAACTTATCACACAGGTAAGGCGG3′，其中GATCC為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，AGCTT為HindⅢ酶切位點(diǎn)

6、,GCCTTACCTGTGTGATAAG為設(shè)計的siRNA序列，TTCAAGAGA轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾環(huán).將上述兩條寡核苷酸片段分別溶于雙蒸水中至終濃度為50pmol/L.30μL退火體系中加入：10×退火緩沖液3μL，兩種寡核苷酸片段各13.5μL.加熱至95℃，于37℃恒溫孵箱內(nèi)放置2h.退火產(chǎn)物與線性化的pSilencerTM3.1H1neo載體連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，選取載體中的EcoRI酶切位點(diǎn)和克隆片斷中的HindⅢ酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，鑒定片段是否插入目的載體中，選取陽性

7、克隆由上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行測序，以確定其是否為目的片段.同時設(shè)計非特異性序列：5′TTCTCCGAACGTGTCACGT3′，與人類基因無同源性，可以作為陰性對照.1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染將人宮頸癌細(xì)胞系HeLa以5×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，當(dāng)細(xì)胞長至80%匯合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染操作方法按照LipfectamineTM2000說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48h后收取細(xì)胞樣品，用于RTPCR和蛋白印跡檢測.1.2.3RTPCR檢測運(yùn)用軟件PrimerP

8、remier5.0針對miz1基因的cDNA設(shè)計引物，其上游引物為：5′gatgacatggtcacgctggctacc3′，下游引物為：5′gcatgtgcgaatccacacagccca3′，產(chǎn)物為248bp的片段.針對gapdh的cDNA設(shè)計引物，其上游引物為：5′gcctcaagatcatcagcaat3′，下游引物為：5′aggtccaccactgacacgtt3′，產(chǎn)物為307bp的片段.按Trizol試劑盒操作說明提取轉(zhuǎn)染所得細(xì)胞的總RNA，紫外分光光