實驗八：微生物大小及數(shù)量測定

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1、實驗八：微生物大小及數(shù)量測定一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握使用顯微測微尺測定微生物大小的方法；2、掌握對不同形態(tài)細菌大小測定的分類學(xué)基本要求，增強對微生物細胞大小的感性認識；3、學(xué)習(xí)并掌握使用血細胞計數(shù)板測定微生物細胞或孢子數(shù)量的方法。二、實驗原理1、微生物大小的測定微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小測定需借助測微尺---目鏡測微尺和鏡臺測微尺，兩者配合使用。鏡臺測微尺是一個在特制載玻片中央封固的標準刻尺，其尺度總長為1mm，精確分為10個大格，每個大格又分為10個小格，共100個小格，每個小格10μm。鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小，

2、而是用于校正目鏡測微尺每格地相對長度。目鏡測微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，一般有等分為50小格和100小格兩種。測量時，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經(jīng)顯微鏡放大后的細胞物像。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格在不同條件下所代表的實際長度也不一樣。因此，用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺進行校正，以求該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。然后根據(jù)微生物細胞相當(dāng)于目鏡測微尺的格數(shù)，即可計算出細胞實際大小。2、顯微直接計數(shù)法5將小量待測樣品懸浮液置于計菌器上，于顯微

3、鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細菌、霉菌孢子等。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤（PetrofHausser）細菌計數(shù)板或Hawksley計數(shù)板。三種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間較寬的平臺，被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)。計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)（大方格）分為16個中方格，而每個中方格又

4、分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。計數(shù)區(qū)由400個小方格組成。每個大方格邊長為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常測定五個中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一個大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1毫升菌液中微生物的數(shù)量。設(shè)5個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)B，則：1mL菌液中的總菌數(shù)=×25×104×B=5×104×A·B（25個中格）=×16×104×B=3.2×104×A·B（16個中格）三、溶液試劑1、菌種

5、：釀酒酵母、枯草芽孢桿菌；2、溶液試劑：0.1%呂氏堿性美藍染液，蒸餾水；3、儀器及其他用品：目鏡測微尺、鏡臺測微尺、普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、血細胞計數(shù)板、移液器、錐形瓶、雙層瓶（含二甲苯、香柏油）等。四、實驗內(nèi)容1、微生物大小的測定（1）目鏡測微尺的安裝把一側(cè)5目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）校正目鏡測微尺將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，利用推進器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某

6、一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。由于已知鏡臺測微尺每格長10μm，根據(jù)下列公式即可分別計算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每格所代表的長度。目鏡測微尺每格長度（μm）=（3）菌體大小的測定①　制作枯草芽孢桿菌的單染色制片洗片→干燥→加熱、固定、干燥→美藍染色1min30s→自然干燥②　制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美藍→接種酵母菌→蓋蓋玻片③　將鏡臺測微尺取下，換上細菌制片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大

7、小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。同一種群中的不同菌體細胞之間也存在個體差異，因此在測定每一種菌種細胞大小時應(yīng)對多個細胞進行測量，然后計算取平均值。本次實驗取三個。2、顯微鏡計數(shù)（1）血球計數(shù)板清洗。（2）自然干燥。（3）對酵母菌液進行適當(dāng)?shù)奶荻认♂?。取原?mL到試管中，用移液管移取9mL水注入試管中。再取上一次稀釋的菌液中的1mL加到另一支試管中，加9mL水。依此類推。即可得到一系列稀釋梯度的菌液。（4）加樣品。血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，將