實(shí)驗(yàn)八：微生物大小及數(shù)量測(cè)定

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1、實(shí)驗(yàn)八：微生物大小及數(shù)量測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握使用顯微測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法；2、掌握對(duì)不同形態(tài)細(xì)菌大小測(cè)定的分類學(xué)基本要求，增強(qiáng)對(duì)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)；3、學(xué)習(xí)并掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞或孢子數(shù)量的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、微生物大小的測(cè)定微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小測(cè)定需借助測(cè)微尺---目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺，兩者配合使用。鏡臺(tái)測(cè)微尺是一個(gè)在特制載玻片中央封固的標(biāo)準(zhǔn)刻尺，其尺度總長(zhǎng)為1mm，精確分為10個(gè)大格，每個(gè)大格又分為10個(gè)小格，共10

2、0個(gè)小格，每個(gè)小格10μm。鏡臺(tái)測(cè)微尺并不直接用來(lái)測(cè)量細(xì)胞的大小，而是用于校正目鏡測(cè)微尺每格地相對(duì)長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，一般有等分為50小格和100小格兩種。測(cè)量時(shí)，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測(cè)量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物像。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測(cè)微尺每小格在不同條件下所代表的實(shí)際長(zhǎng)度也不一樣。因此，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物大小時(shí)，必須先用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正，以求該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的相對(duì)

3、長(zhǎng)度。然后根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，即可計(jì)算出細(xì)胞實(shí)際大小。2、顯微直接計(jì)數(shù)法5將小量待測(cè)樣品懸浮液置于計(jì)菌器上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤（PetrofHausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板或Hawksley計(jì)數(shù)板。三種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)

4、板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬的平臺(tái)，被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)（大方格）分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。計(jì)數(shù)區(qū)由400個(gè)小方格組成。每個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，其面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋載玻片間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常測(cè)定五個(gè)中方格的微生物數(shù)量，求其平均值，再乘以25或16，

5、就得到一個(gè)大方格的總菌數(shù)，然后再換算成1毫升菌液中微生物的數(shù)量。設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)B，則：1mL菌液中的總菌數(shù)=×25×104×B=5×104×A·B（25個(gè)中格）=×16×104×B=3.2×104×A·B（16個(gè)中格）三、溶液試劑1、菌種：釀酒酵母、枯草芽孢桿菌；2、溶液試劑：0.1%呂氏堿性美藍(lán)染液，蒸餾水；3、儀器及其他用品：目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、移液器、錐形瓶、雙層瓶（含二甲苯、香柏油）等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、微生物大小的測(cè)定（1）目鏡測(cè)微尺的安

6、裝把一側(cè)5目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測(cè)微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）校正目鏡測(cè)微尺將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在顯微鏡的載物臺(tái)上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調(diào)焦距，待看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度相平行，利用推進(jìn)器移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺所占的格數(shù)。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進(jìn)行校正，分別測(cè)出在高倍鏡和油鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。由于已知鏡臺(tái)測(cè)

7、微尺每格長(zhǎng)10μm，根據(jù)下列公式即可分別計(jì)算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度（μm）=（3）菌體大小的測(cè)定①　制作枯草芽孢桿菌的單染色制片洗片→干燥→加熱、固定、干燥→美藍(lán)染色1min30s→自然干燥②　制作酵母水浸片玻片中央滴一滴美藍(lán)→接種酵母菌→蓋蓋玻片③　將鏡臺(tái)測(cè)微尺取下，換上細(xì)菌制片，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)量菌體的大小。先量出菌體的長(zhǎng)和寬占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，再以目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度計(jì)算出菌體的長(zhǎng)和寬。同一種群中的不同菌體細(xì)胞之間也存在個(gè)

8、體差異，因此在測(cè)定每一種菌種細(xì)胞大小時(shí)應(yīng)對(duì)多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，然后計(jì)算取平均值。本次實(shí)驗(yàn)取三個(gè)。2、顯微鏡計(jì)數(shù)（1）血球計(jì)數(shù)板清洗。（2）自然干燥。（3）對(duì)酵母菌液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂尅Ｈ≡?mL到試管中，用移液管移取9mL水注入試管中。再取上一次稀釋的菌液中的1mL加到另一支試管中，加9mL水。依此類推。即可得到一系列稀釋梯度的菌液。（4）加樣品。血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，將